Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 20 стр.

раются на старте разделяющего геля. Разделение белков ведут при 300 В,
10–5 мА/см2 в течение 1.5–2 ч, пока полоса лидирующего красителя не
приблизится к нижней границе геля. Гели окрашивают на активность и на
гомогенность соответствующими методами.

              Работа 2. Электрофорез белков с ДДС по Лэммли

     Белки, обработанные концентрированным раствором додецилсульфата
натрия (ДДС) в присутствии β-меркаптоэтанола, распадаются на отдель-
ные полипептидные цепи и приобретают отрицательный заряд, значитель-
но превышающий собственный заряд белковой молекулы. При последую-
щем разделении с помощью диск-электрофореза в ПААГ белковые зоны
распределяются таким образом, что подвижность белковой зоны обратно
пропорциональна логарифму молекулярной массы.
     ДДС – ионное соединение с поверхностно-активными свойствами,
часть молекул отрицательно заряжена. ДДС адсорбируется на гидрофоб-
ных участках цепи, что приводит к денатурации белка. Т. к. предваритель-
ная обработка белка и последующий электрофорез проводят в ДДС, то в
данном случае фактически определяют молекулярную массу отдельных
полипептидных цепей.
     Оборудование и реактивы.
     Прибор для электрофореза, водяная баня.
     Электродный буфер: 1.2 г трис, 5.7 г глицина, 0.1 % ДДС в 1 л водного
раствора, рН 8.3. Буфер для проб: 0.756 г трис, 1 г ДДС, 10 мл глицина,
5 мл β-меркаптоэтанола, 1 мг бромфенолового синего, концентрированная
HCl до рН 6.8 в 100 мл раствора.
     Растворы для гелей: 1) 30 г акриламида, 0.8 г N,N-
метиленбисакриламида в 100 мл водного раствора, 2) 280 мг персульфата
аммония в 100 мл водного раствора, 3) 18.6 г трис, 0.4 г ДДС, концентри-
рованная HCl до рН 8.8 (примерно 2.7 мл) в 100 мл водного раствора,
4) 6.04 г трис, 0.4 г ДДС, концентрированная HCl до рН 6.8 (примерно 4.6 мл)
в 100 мл раствора воды. Все растворы, кроме раствора (2), можно хранить
несколько месяцев в холодильнике, раствор (2) готовить еженедельно.
     Разделяющий гель (15 % акриламида, 0.375 М трис-буфера, 0.1 % ДДС):
2 части раствора (1), 1 часть раствора (2), 1 часть раствора (3), 0.0012 части
ТЕМЕД. Полимеризуется за 30–40 мин при комнатной температуре (сли-
                                     20