Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т. - 25 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

ВГУ | Воронеж

Составители: 

Рубрика: 

25
ТЕМА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
ФЕРМЕНТОВ
Кинетика ферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от
ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора, вследст-
вие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций.
Ферментативная активность зависит, в основном, от следующих фак-
торов: концентрация фермента и субстрата, рН, присутствие ингибиторов
и активаторов.
Работа 1. Определение константы Михаэлиса
Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса – Ментен, можно оп-
ределить кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (К
м
) и
максимальную скорость.
max
m
V[S]
V=
K+[S]
В случае односубстратной реакции задача сводится к получению се-
рии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции
от концентрации субстрата, и к соответствующей графической обработке
этих данных. В более часто встречающихся случаях двух- или трехсуб-
стратной реакции эксперимент ставят таким образом, чтобы, меняя кон-
центрацию одного из субстратов, обеспечить присутствие
другого в насы-
щающей концентрации.
Условия проведения ферментативной реакции. Прежде чем приступить
к постановке кинетических экспериментов, необходимо выполнить ряд ус-
ловий.
1.
Подобрать концентрацию фермента, при которой скорость реак-
ции была бы пропорциональна количеству добавляемого белка-
катализатора.
2.
Подобрать условия инкубации, при которых обеспечивалось бы
постоянство всех параметров кроме того, который исследуется, т. е. в ходе
эксперимента не должна изменяться температура.
3.
Начинать реакцию следует внесением фермента или одного из
субстратов, добавляемых в минимальном объеме при быстром перемеши-
вании реакционной смеси. 
      ТЕМА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
                      ФЕРМЕНТОВ

     Кинетика ферментативной реакции (т. е. зависимость скорости реакции от
ее условий) определяется в первую очередь свойствами катализатора, вследст-
вие чего она значительно сложнее, чем кинетика некаталитических реакций.
     Ферментативная активность зависит, в основном, от следующих фак-
торов: концентрация фермента и субстрата, рН, присутствие ингибиторов
и активаторов.

               Работа 1. Определение константы Михаэлиса

    Если фермент подчиняется кинетике Михаэлиса – Ментен, можно оп-
ределить кинетические параметры реакции: константу Михаэлиса (Км) и
максимальную скорость.
                                   V [S]
                              V = max
                                  K m + [S]
    В случае односубстратной реакции задача сводится к получению се-
рии данных, характеризующих зависимость начальной скорости реакции
от концентрации субстрата, и к соответствующей графической обработке
этих данных. В более часто встречающихся случаях двух- или трехсуб-
стратной реакции эксперимент ставят таким образом, чтобы, меняя кон-
центрацию одного из субстратов, обеспечить присутствие другого в насы-
щающей концентрации.
    Условия проведения ферментативной реакции. Прежде чем приступить
к постановке кинетических экспериментов, необходимо выполнить ряд ус-
ловий.
    1. Подобрать концентрацию фермента, при которой скорость реак-
ции была бы пропорциональна количеству добавляемого белка-
катализатора.
    2. Подобрать условия инкубации, при которых обеспечивалось бы
постоянство всех параметров кроме того, который исследуется, т. е. в ходе
эксперимента не должна изменяться температура.
    3. Начинать реакцию следует внесением фермента или одного из
субстратов, добавляемых в минимальном объеме при быстром перемеши-
вании реакционной смеси.
                                    25

Страницы