Физико-химические основы биолюминесцентного анализа. Кудряшева Н.С - 63 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

125
сначала на аналитических весах взвесим m граммов NADH
(0,001г<m<0,002г). Затем рассчитаем количество миллилитров
воды (х мл), которые надо добавить к m граммам навески,
пользуясь пропорцией:
4⋅ 10
-4
·709 граммов NADH должно содержаться в 1000 мл раствора
m ----------------------------------------------------------- х
2836
10
709104
1000
7
4
mm
х =
⋅⋅
=
−
.
Если 0,001г<m<0,002г, то х должно находиться в интервале
приблизительно от 3 до 6 мл.
В стеклянную кювету с помощью микропипеток со смен-
ными наконечниками помещают в указанном для реакционной
смеси порядке (1-5) указанные объемы растворов реактивов.
Кювета помещается в кюветное отделение биолюминометра.
Включается самописец. Регистриру-ется свечение, которое по-
степенно выходит на максимальный
стационарный уровень.
Измеряются интенсивность стационарного свечения I
0
и время
выхода на максимум t. Повторить несколько раз. Получить 6-8
сопоставимых результатов. Рассчитать средние величины этих
параметров и среднеквадратичное отклонение.
126
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА N3 (4 ЧАСА).
ЗАВИСИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОСТИ
БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ОТ КОНЦЕНТРАЦИЙ
СУБСТРАТОВ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ РЕАКЦИИ
Как указывалось выше, скорость любой химической реак-
ции, в том числе и биолюминесцентной, при небольших кон-
центрациях реагирующих веществ
определяется законом
действия масс, т. е. растет с ростом концентраций реагентов.
Для биолюминесцентных реакций существуют оптимальные
концентрации реагентов, выше которых наблюдается умень-
шение выхода биолюминесценции, обра-зующееся в химиче-
ском процессе. Молекулы FMN, например, как многие
красители, могут образовывать нелюминесцентные ассоциаты
как между собой, так и со свои-ми производными, связанными
с ферментом; избыточные количества алифатического альдеги-
да способны блокировать гидрофобные и гидрофильные участ-
ки фермента, препятствуя проведению химической реакции, и
т.д.
Цель работы
состоит в изучении зависимости интенсивно-
сти биолюминесценции биферментной системы от концентра-
ций реагирующих веществ - FMN, альдегида, NADH,
фермента.
Используемые реактивы и растворы:
- тетрадеканаль, спиртовый раствор 0.25 об.%;
- ферменты - комплект реактивов аналитической биолюминес-
ценции (КРАБ). В состав КРАБа входят препарат бактериаль-
ной люциферазы и NADН:FMN-оксидоредук-тазы;
- фосфтатный буфер 0.02М, рН 7.0;
- никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
(NADH);
- флавинмононуклеотид (FMN), водный раствор

Страницы