Физико-химические основы биолюминесцентного анализа. Кудряшева Н.С - 62 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

123
не раньше чем через 10 мин после разведения фермента буфе-
ром.
В стеклянную кювету с помощью микропипеток со смен-
ными наконечниками помещают в указанном для реакционной
смеси порядке (1-2-3) указанные объемы растворов реактивов.
Кювета помещается в кюветное отделение биолюминометра и
устанавливается напротив ФЭУ с помощью пружинной крыш-
ки биолюминометра. Реакция запускается после
нажатия кноп-
ки дозатора порцией FMNН
2
. Одновременно с кнопкой
дозатора надо запустить самописец. Наблюдать отклонение пе-
ра самописца. Повторить несколько раз до получения сопоста-
вимых отклонений. Измерить интенсивность I
0
биолюминесцентного сигнала в милливольтах, а также ширину
кинетической кривой при интенсивности, равной половине
максимальной τ
1/2
, в секундах.
Использовать вместо тетрадеканаля деканаль. Повторить
эксперименты. Регистрировать изменение I
0
и τ
1/2
.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА N2 (2 ЧАСА).
КИНЕТИКА БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ
БИФЕРМЕНТНОЙ СИСТЕМЫ
ЛЮЦИФЕРАЗА - NADН:FMN-ОКСИДОРЕДУКТАЗА
Данная биолюминесцентная система отличается от рас-
смотренной в лабораторной работе N1 тем, что восстановление
FMN до FMNН
2
здесь осуществляется не фотохимическим пу-
тем, а в результате реакции, катализируемой ферментом
NADН:FMN-оксидоредуктаза:
FMN + NADН= FMN H
-
+ NAD
+
.
С помощью этой реакции в системе на протяжении до-
вольно большого интервала времени происходит постоянная
124
наработка FMNН
2
, в результате чего поддерживается постоян-
ное (стационарное) свечение.
Цель работы
состоит в регистрации кинетики биолюми-
несценции биферментной системы.
Используемые реактивы и растворы:
- тетрадеканаль, спиртовый раствор 0.25 об.%;
- ферменты - комплект реактивов аналитической биолюминес-
ценции (КРАБ). В состав КРАБа входят препарат бактериаль-
ной люциферазы и NADН:FMN-оксидоредук-тазы;
- фосфтатный буфер 0.02М, рН 7.0;
- никотинамидадениндинуклеотид восстановленный (NADH).
Состав реакционной смеси:
1. 50 мкл 0.0025%-ного водного раствора альдегида;
2. 5мкл КРАБа;
3. 200 мкл 0.25 M фосфатного буфера, рН 7.0;
4. 200 мкл 4 10 5
-4
М раствора NADH;
5. 50 мкл 5,4 10 5
-4
M раствора FMN.
Ход работы
Перед началом работы готовят нужные концентрации ре-
активов.
1. Для получения 0.0025% раствора тетрадеканаля 50 мкл
0.25%-ного спиртового раствора тетрадеканаля разводят в 100
раз фосфотным буфером (добавляется 5 мл буфера).
2. К стандартной упаковке препарата КРАБа добавляется
0.5 мл буфера. Измерение свечение должно производиться не
раньше чем через 10 мин после разведения ферментов буфе-
ром.
3.
Приготовить раствор NADH концентрации 4 10
-4
М.
(Mолекулярная масса NADH (соль Na) равна 709.) Для этого

Страницы