Экология микроорганизмов экстремальных водных систем. Намсараев Б.Б - 73 стр.

   Обнаружение отдельных генов и геномных последовательностей
   С обнаружением отдельных генов или специфических геномных
последовательностей связаны прежде всего возможности анализа
микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных
его членов в чистых культурах. Методы основаны на экстракции из
почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее
очистки     и   анализа    с   помощью      градиентных    гель-
электрофоретических TGGE/DGGE-методов. Основная трудность
при экстракции тотальной ДНК связана с ее отделением и очисткой
от гуминовых веществ почвы, хотя методы, позволяющие прово-
дить такую очистку, постоянно совершенствуются.
   После экстракции ДНК подвергают иммобилизации на нитро-
целлюлозном или нейлоновом фильтре, плавят и затем гибридизи-
руют с известными последовательностями генов, ответственными
за синтез тех или иных специфических ферментов. Так, наличие в
пробе тотальной ДНК генов, гибридизуемых с геном, кодирующим
нитрогеназу, говорит о присутствии в анализируемом сообществе
азотфиксаторов и т.д. Генов, кодирующих ключевые реакции тех
или иных процессов, расшифровано уже несколько десятков, и при-
менение метода гибридизации дает возможность делать выводы о
наличии определенных микроорганизмов в анализируемой пробе.
   Метод ПЦР позволяет идентифицировать неизвестные микроор-
ганизмы, находящиеся в природной пробе, без выделения чистых
культур. Разработаны «универсальные» праймеры на бактерии, ар-
хеи и эукариоты, которые позволяют специфически амплифициро-
вать последовательности этих трех разных групп микроорганизмов,
разделить их с помощью TGGE/DGGE-методов, и затем, после вто-
ричной амплификации отдельных полос, получить почти полный
профиль микробного сообщества с идентификацией отдельных фи-
логенетических линий и классификацией микроорганизмов на ос-
нове последовательностей 16S рРНК.
   Для идентификации нужных микроорганизмов в сообществе ис-
пользуют гены-репортеры, которые легко обнаруживаются после
проведения химических реакций. Также гены-репортеры использу-
ют обычно для обнаружения тех или иных видов активности в при-
родных образцах при определении выживаемости введенных в них
микроорганизмов, для обнаружения экспрессии и изучения актив-
ности нужного гена/фермента, под контролем промотора которого
                              73