Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 12 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 9
MitoTracker Green FM позволяет локализовать митохондрии в живых клетках
дрожжей, а LisoTracker Red FM начинает флуоресцировать в лизосомах. Такие
красители не надо тщательно отмывать, поскольку в водной среде они не
способны излучать свет.
Наибольшее применение для исследования тканей и клеток самого разного
происхождения находят флуоресцентные красители, специфически
окрашивающие нуклеиновые кислоты. Независимо от состава оснований,
нуклеиновые кислоты
окрашивает бромистый этидий, дающий красную
флуоресценцию при возбуждении синим светом, и йодистый пропидий (PI),
одинаково эффективно окрашивающий как РНК, так и ДНК и испускающий
красный свет в ответ на облучение зеленым светом. Молекулы акридинового
оранжевого по-разному взаимодействуют с однонитевыми и двунитевыми
молекулами РНК и ДНК. В результате окрашивания двунитевые молекулы
нуклеиновых
кислот флуоресцируют зеленым светом, а однонитевые – красным
(Протокол 2.2.2).
Протокол 2.2.2. Окраска нуклеиновых кислот акридиновым оранжевым
1. Приготовить концентрированный раствор акридинового оранжевого:
100 мг на 100 мл дистиллированной воды (может храниться в темноте
при 4
о
С).
2. Провести зафиксированные препараты по серии спиртов понижающейся
концентрации – 96%; 70%; 50% этанол.
3. Поместить на 5 мин в PBS (pH 6,0).
4. Окрашивать 15 мин свежеприготовленным рабочим раствором
акридинового оранжевого (1 часть концентрированного раствора на 9
частей PBS (pH 6,0)).
5. Стряхнуть краску и промыть в 2 сменах PBS по 2 мин.
6. Заключить препарат.
Формалиновая фиксация может нарушить окрашивание, лучше использовать
спиртовые фиксаторы или метанол-ЛУК (3:1). Использование ацетатного
буфера pH 4,2 вместо PBS позволяет получить более резкие цветовые различия
между ДНК и РНК.
Еще один ДНК-связывающий флуорохром, положивший начало
использованию флуоресцентной микроскопии для идентификации хромосом
методом Q-бэндинга – это акрихин. Он обладает небольшой специфичностью к
GC-парам и поэтому позволяет получать дифференциально окрашенные
хромосомы (Протоколы 2.2.3-2.2.4).
Протокол 2.2.3. Q-бэндинг митотических хромосом с акрихином
Подкисленная вода: Кислотность бидистиллированной воды довести 0,1N HCl
до pH 4,5;
Раствор красителя: 0,25 мг акрихина (Quinacrine dihydrocloride, Sigma)
растворить в 50 мл бидистиллированной воды, довести кислотность 0,1N
HCl до pH 4,5.
1. Размочить препараты хромосом в дистиллированной воде.
2. Окрашивать раствором акрихина 15 минут.
3. Промыть 3 раза по 3 мин в подкисленной воде.

Страницы