Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 14 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 11
Протокол 2.2.6. Окраска хромосом хромомицином А3/дистамицином А
Раствор красителя: 0,5 мг/мл раствор хромомицина А3 в дистиллированной
воде оставить на 1 неделю при 4
о
С в темноте для созревания.
Контрастирующий раствор: 0,2 мг/мл дистамицина А в буфере Зёренсена (pH
6,8). Дистамицин А в водном растворе нестоек, хранить при -20
о
С в
аликвотах, не размораживая.
1. Смешать красящие растворы 1:1 и нанести на препарат.
2. Окрашивать в темноте в течение 20-30 мин при комнатной температуре.
3. Сполоснуть препарат в буфере Зёренсена (pH 6,8).
4. Заключить препарат в фотозащитную среду и исследовать под
микроскопом.
При необходимости получения окраски, похожей на G-бэндинг,
используются АТ-специфичные флуоресцентные красители DAPI (Sigma) и
Hoechst 33258 (Hoechst), дающие голубое свечение при облучении
ультрафиолетом. При необходимости контрастирования, можно сочетать
окрашивание с обработкой актиномицином D, специфически связывающим GC-
пары и поглощающим излучение без флуоресценции (Протокол 2.2.7).
Протокол 2.2.7. Окраска АТ-обогащенной ДНК на препаратах хромосом
Контрастирующий раствор: 0,1 мM свежеприготовленный
раствор
актиномицина D (Mr. 1255,5) в буфере Макильвейна (pH 6,8).
Раствор красителя: 1 мкг/мл DAPI в буфере Макильвейна (pH 6,8) или
100 мкг/мл Hoechst 33258 в буфере Макильвейна (pH 6,8) или любом
другом буфере с низким содержанием NaCl.
1. Гидратировать препараты в серии спиртов понижающейся концентрации.
2. Поместить в буфер Макильвейна (pH 6,8) на 2 мин.
3. Обработать контрастирующим раствором в течение 20 мин.
4. Промыть 2 мин в буфере Макильвейна (pH 6,8).
5. Окрасить препараты раствором одного из красителей в течение 15 мин.
6. Промыть препараты буфером Макильвейна (pH 6,8).
7. Заключить в фотозащитный раствор и исследовать под микроскопом.
Часто окраску нуклеиновых кислот флуорохромами сочетают с другими
методами флуоресцентной микроскопии. Эту процедуру проводят после
завершения всех манипуляций непосредственно перед заключением препарата
(Протокол 2.2.8).
Протокол 2.2.8. Окраска нуклеиновых кислот различными флуорохромами
Рабочий раствор DAPI: 0,02 мкг/мл в 2х SSC.
Рабочий раствор PI: 1-10 мкг/мл в 2х SSC.
Концентрированный раствор YOYO-1: 2,5мкМ в DMSO, хранить при 4
о
С.
Рабочий раствор YOYO-1: свежеприготовленный 2,5 нМ раствор в 2х SSC
Концентрированный раствор SYTO-1: 1мМ в DMSO, хранить при 4
о
С.
Рабочий раствор SYTO-1: свежеприготовленный 10 мкМ раствор в 2х SSC.
Концентрированный раствор TO-PRO-3: 1мМ в DMSO, хранить при 4
о
С.
Рабочий раствор TO-PRO-3: свежеприготовленный 1 мкМ раствор в 2х SSC.

Страницы