Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 16 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 13
Протокол 2.2.10. Прижизненная окраска клеток в культуре
1. Вырастить монослой клеток на покровном стекле.
2. Растворить 25 мг SITC в 10 мл культуральной среды (до конечной
концентрации 2,5 мг/мл).
3. Инкубировать клеточную культуру в среде с краской 48 часов.
4. Заключить монослой клеток в том же растворе SITC в среде для
культивирования и исследовать под микроскопом.
В живых клетках окрашиваются цитоплазматические везикулы вокруг ядра, а у
мертвых клеток флуоресцирует только мембрана. Если такой препарат
зафиксировать в растворе, содержащем спирт, то краситель вымывается из
цитоплазмы и интенсивно окрашивает ядро.
Протокол 2.2.11. Окраска лизосом в живых клетках
Концентрированный раствор акридинового оранжевого – 1 мг краски в 2 мл
буфера Макильвейна, довести pH до 7,3 минимальным количеством HCl
или NaOH.
Рабочий раствор: 1 мл концентрированного раствора развести в 99 мл буфера
Макильвейна, при необходимости довести pH до 7,3.
1. Вырастить монослой клеток на покровном стекле.
2. Отмыть клетки от культуральной среды буфером Макильвейна.
3. Инкубировать 5 мин в свежеприготовленном рабочем растворе
красителя.
4. Сполоснуть несколько секунд в буфере Макильвейна, заключить
препарат в том же буфере и исследовать под микроскопом.
Лизосомы живых клеток флуоресцируют оранжевым цветом. Мертвые клетки
имеют ярко-красную флуоресценцию цитоплазмы и ярко-зеленую ядер.
Протокол 2.2.12. Прижизненная окраска митохондриальной ДНК в
клетках дрожжей
1. Подготовить раствор DAPI (1,0 мкг/мл) на питательной среде для
выращивания клеток.
2. Инкубировать клетки в растворе красителя на предметном стекле.
3. Исследовать под микроскопом.
Ярко флуоресцируют многочисленные митохондрии в цитоплазме. Отдельные
клетки имеют слабо окрашенные ядра.
Использование флуоресцирующих конъюгатов липополисахаридов и
декстрансульфата позволяет проводить прижизненное исследование
эндоцитоза. Хотя в данном случае никакого окрашивания не происходит,
наблюдение за флуоресцирующими частицами различных размеров позволяет
следить за динамикой внутриклеточных процессов.

Страницы