Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 15 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 12
1. Препараты сполоснуть 2x SSC.
2. Провести окрашивание рабочим раствором красителя:
DAPI – 1-3 мин
PI – 1-5 мин для нативного хроматина,
– 15-30 мин – после денатурации.
TO-PRO-3 – 5 мин.
YOYO-1 – 30-40 мин.
SYTO 16 – 10 мин.
3. Сполоснуть 2х SSC.
4. Заключить в фотозащитный раствор и исследовать под микроскопом.
Иногда удобно добавить краситель непосредственно в заключающую среду
(Протокол 2.2.9). Для этой цели подходят красители, слабо флуоресцирующие в
водных растворах, такие как DAPI или PI, или димерные красители, такие как
TOTO-1, дающие яркий флуоресцентный сигнал только в том случае, если
произошло взаимодействие молекулы красителя с нуклеиновой кислотой.
Протокол 2.2.9. Совмещенная с заключением окраска нуклеиновых
кислот
Концентрированный раствор DAPI: 0,5 мг/мл водный раствор, хранить в
темноте при -20
о
С.
Концентрированный раствор PI: 1 мг/мл водный раствор, хранить в темноте
при -20
о
С.
Концентрированный раствор хромомицина А3: 0,5 мг/мл водный раствор,
оставить на 1 неделю при 4
о
С в темноте для созревания.
1. Добавить краситель непосредственно в фотозащитную заключающую
среду: DAPI – 50 нг/мл; PI – 1 мкг/мл; хромомицин А3 – 20 мкг/мл.
2. Заключить препараты в подготовленную среду с красителем и оставить в
темной коробочке при 4
о
С на несколько часов (для DAPI и PI) или на
несколько дней, вплоть до 2 недель (для хромомицина А3).
3. Исследовать препараты под микроскопом.
Использование парарозанилина, акрифлавина или аурамина О в качестве
цветного реактива в реакции Фельгена позволяет производить количественную
оценку ДНК на препарате. Красители OliGreen, PicoGreen и RiboGreen дают
возможность проводить количественную оценки ДНК (одно и двунитевой) и
РНК в водных растворах, а система SYTO RNASelect Green Fluorescent Cell
Stain (Molecular Probes) селективно окрашивает РНК на препаратах.
Для прижизненного окрашивания организмов используют водные растворы
акридинового оранжевого, дигидроэдидиума, SITS, диацетата флуоресцина,
SYNTOX и DAPI, поскольку для получения детектируемого свечения
достаточно использовать эти флуорохромы в очень низких концентрациях
(Протоколы 2.2.10-1.1.12).

Страницы