Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 17 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 14
2.3. Иммуноцитохимия
В основе метода лежит способность антител специфически связываться с
определенными веществами в клетках и тканях на препаратах. В отличие от
гистохимических методов, использование антител позволяет достичь
значительно более высокой точности распознавания для тех или иных веществ.
Однако внедрение иммуноцитохимических методов в практику стало возможно
только после того, как удалось разработать способы конъюгации молекул
красителя с антителами без нарушения их иммунных свойств.
С 30-х годов прошлого столетия метод претерпел несколько этапов
развития и стал значительно точнее и эффективнее. В настоящее время
исследователь может использовать не только высоко-специфичные афинно-
очищенные моноклональные антитела вместо поликлональных антисывороток,
но и F(ab’)
2
фрагменты иммуноглобулинов, состоящие из вариабельных частей
легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов. Такие укороченные молекулы
более специфично связываются с мишенью на препарате и меньше подвержены
деградации.
При осуществлении непрямого метода иммуноцитохимического
окрашивания используют антитела против исследуемого белка, полученные в
результате иммунизации того или иного животного. А они уже специфически
распознаются меченными
флуорохромами антителами против
иммуноглобулинов того животного, в котором были выработаны первые
антитела (Рисунок 2.1). В случае прямого метода используют антитела против
исследуемого вещества непосредственно конъюгированные с репортерными
молекулами (Рисунок 2.1, А). Подходы, аналогичные иммуноцитохимическим,
могут применяться и с другими реактивами, обладающими высокой
специфичностью распознавания. Например, авидин из яичного белка и
стрептавидин, выделенный из Streptomyces avidinii, обладают высоким
сродством к биотину, а яд бледной поганки фаллоидин очень специфично
распознает фибриллярный актин.
флуорохром
III антитело
флуорохром
II антитело
флуорохром
I антитело
антиген
А Б В
Рисунок 2.1. Схемы экспериментов прямого (А) и непрямого (Б и В) методов.
При проведении иммуноцитохимического окрашивания часто возникает
риск неспецифических реакций. Это может происходить потому, что разные
белки могут иметь одинаковые или сходные эпитопы, распознающиеся
антителами. Кроме того, при нарушении условий хранения (многократных
размораживаниях и замораживаниях, бактериальном заражении) антитела
разрушаются и начинают неспецифически оседать на препарате.
Неспецифическая адсорбция антител может происходить также при

Страницы