Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 18 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 15
использовании слишком высоких концентраций. Чтобы этого не происходило,
необходимо провести серию пробных реакций на препаратах, содержащих
исследуемый антиген, используя последовательные разведения антител.
Разведение подбирают таким образом, чтобы неспецифическое окрашивание
было минимально, в то время как специфическое было достаточно интенсивно.
Коммерческие антитела необходимо хранить согласно инструкции
производителя. В случае использования антисывороток в них добавляют азид
натрия или тимерозол до 0,02% и хранят при 4
о
С, можно также добавить в них
равный объем глицерина – тогда сыворотку можно будет хранить при -20
о
С, но
только до первого размораживания. Как коммерческие, так и некоммерческие
антитела можно размораживать только один раз, а после этого их можно
хранить непродолжительное время при 4
о
С. Поэтому удобнее сразу расфасовать
все имеющиеся антитела на отдельные порции, достаточные для использования
один или несколько раз.
Неспецифическая реакция может быть связана также с неправильной
фиксацией и хранением препарата. Независимо от метода приготовления
препаратов и используемых фиксаторов, препараты во время проведения
иммуноцитохимических реакций нельзя высушивать, особенно до
осуществления соответствующих отмывок. К сожалению, невозможно
порекомендовать один фиксатор для всех возможных иммуноцитохимических
реакций. Выбор фиксатора главным образом зависит от влияния того или иного
реактива на антигенные свойства исследуемого белка. Иными словами при
использовании разных антител, возможно, придется следовать разным
стратегиям фиксации препарата.
Традиционно используются фиксаторы на основе формалина, хлороформа,
ацетона, спиртов, уксусной кислоты (Таблица 2.1), при этом для сохранности
антигена лучше готовить мазки, давленые препараты, разного рода спрэды и
замороженные срезы, чем проводить реакцию на регидратированных
парафиновых срезах. Кроме того, кратковременная фиксация всегда
предпочтительнее, особенно это касается формалиновых фиксаций, поскольку
при длительном хранении из-за возникновения в белковых молекулах
поперечных сшивок появляется сильная автофлуоресценция тканей (Раздел 2.1),
затрудняющая интерпретацию результатов. При исследовании эпитопов,
изменяющих антигенные свойства при высыхании, нельзя использовать
фиксаторы на основе ацетона, в таком случае лучше использовать этанол
различных концентраций. Иногда предпочтительнее использование метанола,
однако в каждом случае фиксатор придется подбирать экспериментально.
Приготовленные препараты лучше использовать как можно быстрее, однако
иногда их можно хранить некоторое время в буферном растворе с 0,01% азидом
натрия или же в 70% этаноле или метаноле. А в том случае, когда возможно
использование высушенных препаратов, их можно хранить при –20
о
С, не
допуская обводнения.

Страницы