Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 17
Еще одним важным фактором, влияющим на получение положительных
результатов, является хорошая адгезия препарата к стеклу, поскольку из-за
многократных отмывок с детергентами плохо приклеенный препарат можно
потерять. Классический способ наклейки на белок в данном случае не подходит,
поскольку это увеличит фоновое неспецифическое связывание антител.
Монослой клеток помещают в фиксатор вместе со стеклом, на котором они
выросли. Для давленых препаратов, мазков и спрэдов используют чистые
обезжиренные стекла, отмытые в растворах детергентов и этаноле, но не в
кислоте, изменяющей заряд поверхности стекла. Для наклеивания срезов можно
покрывать стекла желатином (Протокол 2.3.1) и даже использовать более
сильные адгезивы, такие как поли-L-лизин и аминопропилтриэтоксисилан. В
настоящее время чистые, обработанные полилизином предметные стекла можно
купить, но надо помнить, что они сохраняют свои свойства только при первом
использовании, в дальнейшем с ними надо обращаться как с обычными
стеклами.
Протокол 2.3.1. Обработка предметных стекол желатином
5х концентрированный раствор: В 100 мл горячей дистиллированной воды
добавить 500 мг желатина и довести до полного растворения на водяной
бане при 50
о
С и постоянном покачивании, затем добавить 50 г
хромокалиевых квасцов CrK(SO
4
)
2
x12H
2
O. Раствор можно хранить при
4
о
С.
1. Перед использованием профильтровать необходимое количество
концентрированного раствора и развести дистиллированной водой до
концентрации желатина 0,1% и квасцов - 0,01%.
2. Подогреть готовый раствор до 65
о
С
3. Опустить стекла в теплый раствор вертикально и установить в штатив на
ребро для равномерного стекания и подсыхания.
4. Оставить для полного высыхания в термостате при 65
о
С на ночь.
Обработанные стекла хранить в сухом месте, оберегая от пыли.
Для предотвращения поверхностной адсорбции и уменьшения
неспецифического связывания антител рекомендуется предварительно
обработать препараты блокирующим раствором. Принцип его действия основан
на оккупации участков, способных к связыванию небольших белковых молекул,
поэтому в качестве блокирующих растворов часто используют 10% нормальную
сыворотку или 3% раствор БСА. При выборе блокирующего реагента важно
убедиться, что используемые антитела не имеют кросс-реакции с выбранной
сывороткой. Более качественная забивка получается при использовании 4–6%
обезжиренного сухого молока, однако даже незначительные примеси жира
могут вызвать появление грязных разводов на препарате. Во избежание этого
готовый раствор несколько раз центрифугируют, каждый раз отбирая раствор со
дна и не забирая верхнюю фракцию. В настоящее время выпускаются готовые к
употреблению порошкообразные блокирующие реагенты на основе
измельченных ультразвуком казеинов молока, дающие прекрасный эффект и
удобные в использовании. Вне зависимости от выбранного реагента, его
разводят в 1х PBS или другом физиологичном буфере с pH 6,8–7,2 с
добавлением детергента: 0,05% Triton X-100, 0,02% Saponin или 0,02%
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 18
- 19
- 20
- 21
- 22
- …
- следующая ›
- последняя »
