Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 21 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 18
Tween 20. Тот же раствор рекомендуется для разведения антител и проведения
отмывок, хотя в некоторых случаях долю блокирующего реагента в растворе
можно сократить в несколько раз.
Инкубирование препарата с антителами можно проводить от 30 минут до
нескольких часов, варьируя температуру от 4
о
до 37
о
С, подбирая оптимальные
условия. Чем выше температура, тем быстрее работают антитела, но и больше
неспецифическое связывание. При 4
о
С целесообразно проводить инкубацию в
течение ночи, но в этом случае обязательно добавление в раствор 0,02% азида
натрия или тимерозола.
Отмывку препарата проводят после каждого раунда инкубации с
антителами 3-4 раза в 1х PBS с детергентом по 5 минут при постоянном
покачивании. При использовании непрямого метода каждый этап окрашивания
будет сопровождаться последующей отмывкой.
Протокол 2.3.2. Непрямое иммуноцитохимическое окрашивание
Блокирующий раствор: 3% БСА в 1х PBS; 0,02% Tween 20
Раствор для разведения антител: 1% БСА в 1х PBS; 0,02% Tween 20
Развести антитела в соответствии с результатами пробных экспериментов или
рекомендациями производителей.
1. Сухие и частично дегидратированные препараты насытить водой в серии
спиртов понижающихся концентраций.
2. Поместить стекла на 1–3 мин в 1х PBS.
3. Нанести на препарат 500 мкл блокирующего раствора, накрыть кусочком
парафильма 24х50мм
2
, поставить во влажную камеру и инкубировать 30–
60 мин при 37
о
С.
4. Стряхнуть блокирующий раствор вместе с парафильмом и нанести 200
мкл раствора I антител. Накрыть новым кусочком парафильма и
инкубировать во влажной камере 40–60 мин при 37
о
С.
5. Отмывать в 3 сменах 1х PBS; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24
о
–37
о
С,
непрерывно качая.
6. Нанести на препарат 200 мкл раствора II антител, накрыть кусочком
парафильма, поставить во влажную камеру и инкубировать 40–60 мин
при 37
о
С.
7. Отмывать в 4 сменах 1х PBS; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24
о
–37
о
С,
непрерывно качая.
8. Заключить препарат в фотозащитную среду и исследовать под
микроскопом.
При использовании трех и более антител, пункты 5 и 6 повторяют необходимое
количество раз. Более 5 циклов окрашивания проводить не рекомендуется,
поскольку из-за многократно увеличенного неспецифического связывания
полученные результаты будет трудно интерпретировать. Этапы с 6 по 8
необходимо проводить в темноте.
Иногда для усиления сигнала проводят трехэтапное окрашивание с
использованием как вторых, так и третьих антител, конъюгированных с
флуорохромом (как правило, одним и тем же или с перекрывающимися
спектрами возбуждения и излучения), однако в этом случае возрастает риск
амплификации неспецифического сигнала.

Страницы