Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 23 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 20
Протокол 2.4.1. Получение метафазных хромосом высокого разрешения
Питательная среда для клеток: 385 мл RPMI 1640, 5 мл 200мМ L-глутамина,
10 мл антибиотиков (5000 ед/мл пенициллина и 5000 мкг/мл
стрептомицина), 100 мл фетальной сыворотки, инактивированной
нагреванием.
Гипотонический раствор: 0,075М KCl в дистиллированной воде
Фиксатор: метанол-ЛУК (3:1), охлажденный до –20
о
С
Концентрированный раствор метотрексата: 0,01мМ в дистиллированной
воде
Концентрированный раствор BrdUTP: 1 мг/мл в дистиллированной воде.
1. Культуру лимфоцитов, стимулированную фитогемагглютинином,
инкубировать при 37
о
С.
2. Через 72 часа добавить метотрексат до 0,1мкМ и инкубировать еще 17
часов.
3. Собрать клетки центрифугированием и отмыть осадок дважды
питательной средой.
4. Ресуспензировать клетки в RPMI 1640 с добавлением 20% БСА и
перенести во флакон.
5. Добавить BrdUTP до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубировать 7
часов.
6. За 10 мин до окончания культивирования ввести в среду колцемид
(10 мкг/мл) до конечной концентрации 0,06 мкг/мл.
7. Собрать клетки центрифугированием при 1000g в течение 10 мин и
ресуспензировать в гипотоническом растворе, согретом до 37
о
С.
8. Инкубировать 10 мин в гипотоническом растворе при 37
о
С.
9. Добавить 100 мкл фиксатора в пробирку с гипотоническим раствором и
собрать клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.
10. Ресуспензировать клетки в ледяном фиксирующем растворе и оставить
на 30 мин при –20
о
С.
11. Собрать клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин,
ресуспензировать в новой порции фиксатора и оставить на 10 мин при
–20
о
С.
12. Собрать клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин,
ресуспензировать в новой порции фиксатора и хранить при –20
о
С до
приготовления препаратов.
13. Чистые сухие предметные стекла поместить в 96% этанол и охладить до
4
о
С.
14. Собрать клетки центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин,
ресуспензировать в свежем фиксирующем растворе.
15. Промыть предметное стекло в ледяной дистиллированной воде и
раскапать на него суспензию фиксированных клеток.
16. Внести препарат на несколько секунд в пламя горелки и высушить на
воздухе.
Препараты метафазных хромосом с включенным бромдезоксиуридином
можно окрашивать флуоресцентными красителями или выявлять участки
включения меченого предшественника иммунохимическими методами.

Страницы