Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 22
и хлордезоксиуридина. Антитела к этим предшественникам были
первоначально выделены как побочный продукт при получении антител к
бромдезоксиуридину, поэтому, имея низкую кросс-реакцию между собой, все
они, как правило, достаточно интенсивно окрашивают BrdU. Сроки и
продолжительность инкубации с предшественниками зависит от
продолжительности клеточного цикла культивируемых клеток и целей
исследования, при этом время инкубации с CldUTP не должно превышать 45
мин. Иммунохимическую детекцию включенных предшественников проводят
также как описано в протоколе 2.4.3, последовательно выявляя антителами
сначала включенный CldU, а затем IdU.
Включение предшественников, непосредственно меченных
флуорохромами, позволяет избежать этапа детекции, а также наблюдать за
живыми клетками. Однако флуоресцентные конъюгаты, в отличие от
галогенизированных, не могут преодолеть плазматическую мембрану и попасть
в клетку. Для решения этой проблемы используют два метода: микроинъекция
предшественника в клетку и метод скрэтчинга (нанесение царапин на монослой
клеток стерильной иглой) с последующей инкубацией в среде с меченым
предшественником.
2.5. Мечение нуклеиновых кислот in situ
Иногда возникает необходимость выявления ДНК на уже фиксированных
препаратах. Кроме проведения иммуноцитохимической окраски (раздел 2.3)
антителами к двунитевой ДНК, хорошие результаты дает мечение нуклеиновых
кислот in situ. Во-первых, специфичность работы используемых полимераз
значительно выше специфичности реакции антител на регидратированных
препаратах. Во-вторых, такие методы позволяют решать особые задачи.
Например, если необходимо выявить районы хромосом, обогащенные
однонитевыми разрывами, с успехом применяется метод ник-трансляции in situ
(Протокол 2.5.1). Сам по себе метод несложен, но важно использовать
высококачественную ДНК-полимеразу I, иначе помеченой может оказаться вся
ДНК на препарате. Также важно использовать препараты, не подвергавшиеся
очень длительным фиксациям в метанол-ЛУК (3:1), поскольку в уксусной
кислоте ДНК подвергается гидролизу и, хотя этот процесс не идет так быстро,
как в соляной кислоте, он
может привести к получению неадекватных
результатов. Кроме того, нельзя использовать фиксаторы на основе формалина,
так как даже после длительных отмывок препарата в нем могут оставаться
следовые количества фиксатора, ингибирующие полимеразу. Для данного
метода не рекомендуется использование предшественников ДНК,
непосредственно меченных флуорохромами, так как это снижает
чувствительность метода. Лучше всего использовать
дезоксирибонуклеотиды,
конъюгированные с гаптенами, с последующей иммунохимической детекцией,
что позволяет амплифицировать сигнал.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 23
- 24
- 25
- 26
- 27
- …
- следующая ›
- последняя »
