Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 27 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 24
Протокол 2.5.2. Денатурация ДНК на препарате
1. Сухие препараты подогреть до 60-70
о
С.
2. 70% формамид в 2х SSC налить в высокий стаканчик и нагреть до 70
о
С.
3. Опустить теплые стекла в раствор формамида на 2 мин.
4. Быстро перенести препарат в 70% этанол, охлажденный до –20
о
С,
оставить на 3 мин.
5. Поместить стекло в 80% этанол, охлажденный до –20
о
С на 3 мин.
6. Поместить стекло в 96% этанол, охлажденный до –20
о
С на 3 мин.
7. Высушить препарат на воздухе.
Если подготовленный препарат не был использован в течение нескольких часов,
процедуру придется повторить, но это отрицательно скажется на качестве
зафиксированного материала.
Для осуществления мечения определенной последовательности на
препарате, используют метод полимеразной реакции in situ со специфичными
праймерами (PRINS) (Протокол 2.5.6). В отличие от ПЦР in situ, когда
многократно амплифицированный продукт ПЦР затем смывается с препарата и
анализируется молекулярными методами, в результате реакции PRINS
амплифицированный продукт с включенными мечеными предшественниками
остается на препарате, маркируя место локализации искомой
последовательности. Оба метода объединяет применение термостабильной ДНК
полимеразы, поскольку это дает возможность использовать достаточно длинные
праймеры с высокой температурой отжига. Однако выбор полимеразы для
каждого из методов будет свой. Так, если для ПЦР in situ важно использование
точных полимераз, то для мечения полимеразной реакцией in situ наоборот,
предпочтение будет отдаваться менее точным полимеразам, поскольку это не
имеет большого значения для локализации сигнала, зато такие полимеразы
работают быстрее и менее чувствительны к состоянию ДНК матрицы, что
важно при работе с фиксированными препаратами. Здесь следует снова
отметить, что как и для других методов мечения ДНК in situ для полимеразной
реакции нельзя использовать препараты, фиксированные формалином.
Сложность в осуществление этого метода на практике состоит в том, что
полимераза может использовать в качестве затравки концы нитей ДНК в местах
разрывов и частичной деградации, произошедшей в процессе фиксации. Решать
эту проблему можно несколькими способами. Если возможно использование
щадящей фиксации (например, охлажденными спиртовыми растворами)
избавляться приходиться только от существующих в хромосомной ДНК
разрывов. Для этого используют лигазную реакцию (Протокол 2.5.3).

Страницы