Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 29 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 26
Далее необходимо денатурировать ДНК препарата, чтобы обеспечить ее
комплементарное связывание с праймерами к исследуемой последовательности.
Удобнее всего воспользоваться методом денатурации в 70% формамиде, как
описано в протоколе 2.5.2. Поскольку для проведения мечения мы используем
термостабильную полимеразу, можно денатурировать ДНК препарата уже в
реакционной смеси прямо на стекле, но в этом случае возможно испарение
части воды из-за нарушения целостности контура из резинового клея в условиях
высокой температуры и влажности. Если это происходит, то в оставшемся
буфере изменяется состав и реакция не проходит, а в тех участках, где препарат
подсох, происходит неспецифическая адсорбция меченых нуклеотидов. Чтобы
исключить испарение, некоторые производители выпускают специальные
полипропиленовые наклеивающиеся на предметные стекла камеры с
крышечками. Такие приспособления позволяют проводить денатурацию прямо
на стеклах. Однако они увеличивают стоимость эксперимента не только за счет
собственной цены, но и за счет увеличения объема реакционной смеси в десятки
раз. В том случае, если полимеразная реакция in situ ставится под покровным
стеклом, целесообразно проводить денатурацию заранее.
Протокол 2.5.6. Полимеразная реакция in situ (PRINS)
Реакционная смесь: буфер для Taq ДНК-полимеразы, содержащей 2,5мМ
MgCl
2
; по 0,2 мМ dATP, dCTP, dGTP, 0,13мM dTTP и 0,07мМ
биотинилированного dUTP.
Блокирующий раствор: 3% БСА в 2х SSC; 0,02% Tween 20.
Детектирующий раствор: авидин, стрептавидин или антитела против биотина,
конъгированные с флуорохромом, разведенные в соответствии с
рекомендациями производителя.
1. На сухой препарат нанести 10 мкл реакционной смеси, содержащей по 40
пикомоль праймеров и 1 единицу Taq-полимеразы, накрыть покровным
стеклом 24х24мм
2
и заклеить по контуру резиновым клеем на основе
каучука.
2. Инкубировать 1 мин при температуре отжига праймеров.
3. Поднимать температуру по 1 градусу в мин до 72
о
С.
4. Инкубировать 30 мин при 72
о
С.
5. Отмыть в 4х SSC; 0,1% Tween 20 дважды по 10 мин при комнатной
температуре.
6. Нанести 200 мкл блокирующего раствора под кусочек парафильма и
инкубировать 30-40 мин при 37
о
С во влажной камере.
7. Стряхнуть блокирующий раствор, нанести 100-200 мкл детектирующего
раствора под кусочек парафильма и инкубировать 1 час при 37
о
С во
влажной камере.
8. Отмывать в 4 сменах 2x SSC; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24
о
–37
о
С и
постоянном покачивании
9. Провести по серии спиртов повышающейся концентрации и высушить на
воздухе.
10. Заключить в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом.
Этапы с 7 по 10 по возможности проводить в темноте.

Страницы