Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 31 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 28
7. Нанести 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,25 единиц РНКазина
(ингибитора РНКаз) и 0,5 единиц ревертазы (обратной транскриптазы).
Перевернуть препарат на предметное стекло и инкубировать 90 мин при
42
о
С.
8. Аккуратно смыть стекло буфером RT.
9. Отмыть препарат в 2 сменах 0,5х SSC по 30 мин при 42
о
С.
10. Отмыть препарат в 2 сменах 0,1х SSC по 30 мин при 42
о
С.
11. Нанести 100мкл блокирующего раствора и инкубировать 30-40 мин при
37
о
С во влажной камере.
12. Стряхнуть блокирующий раствор, нанести 100 мкл детектирующего
раствора и инкубировать 1 час при 37
о
С во влажной камере.
13. Отмывать в 4 сменах 2x SSC; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24
о
–37
о
С и
постоянном покачивании
14. Провести по серии спиртов повышающейся концентрации и высушить на
воздухе.
15. Заключить в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом.
Этапы с 12 по 15 проводить в темноте.
2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ
Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе свойства
нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод гибридизации in situ
позволяет точно определить локализацию практически любой
последовательности ДНК или РНК непосредственно в клетке или клеточном
ядре, на метафазных хромосомах, растянутых хроматиновых фибриллах и
микрочипах. Последние 20 лет технология гибридизации in situ интенсивно
развивалась и преобразовалась в целый комплекс методов, включающих:
супрессорную FISH (CISS), одновременную многоцветную FISH, FISH на
растянутых фибриллах, сравнительную геномную гибридизацию (CGH),
хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), M-FISH (многоцветная FISH с зондами к
отдельным хромосомам), межвидовое цветное сегментирование хромосом (R
x
-
FISH), спектральное кариотипирование (SKY), многоцветный бэндинг
хромосом (MCB-FISH), 3D-FISH, а также FISH и CGH на микрочипах. Несмотря
на различия отдельных методов, все они включают этапы денатурации меченого
зонда и нуклеиновых кислот на препарате с последующей их одновременной
ренатурацией.
Получение положительного результата зависит от сохранности
нуклеиновых кислот на препарате. В первую очередь сохранность материала
обеспечивает правильная обработка
предметных стекол. Для давленых
препаратов, мазков и спрэдов используют чистые обезжиренные стекла,
отмытые в растворах детергентов и этаноле. Срезы наклеивают на стекла,
обработанные поли-L-лизином или аминопропилтриэтоксисиланом (Протокол
2.6.1). Использование желатина, так же как и альбумина, в данном случае
невозможно, так как они будут перевариваться протеазами во время
ферментативной предобработки препаратов.

Страницы