Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 29
Протокол 2.6.1. Обработка стекол аминопропилтриэтоксисиланом
1. Отмыть стекла детергентом, интенсивно промыть проточной водой и
сполоснуть в 3 сменах дистиллированной воды.
2. Высушить стекла на воздухе.
3. Опустить каждое стекло на 3 мин в ацетон.
4. Перенести в 2% раствор 3-аминопропилтриэтоксисилана (3-
aminopropyltriethoxysilane, Sigma) на ацетоне и оставить на 5 мин.
5. Сполоснуть в дистиллированной воде и сушить в течение ночи при 65
о
С
6. Готовые стекла убрать в коробочки и хранить в защищенном от пыли
месте.
Фиксацию материала рекомендуется проводить в растворах на основе
формалина и спиртов (Раздел 2.3). При этом длительная фиксация в формалине
затрудняет ферментативное удаление белков, маскирующих нуклеиновые
кислоты из-за образования сшивок, что приводит к снижению эффективности
гибридизации с зондом. Кроме того, при фиксации свыше 24 часов даже при
0
о
С, РНК в тканях практически полностью деградирует. Для сокращения
времени фиксации крупных образцов тканей или органов в 4% PFA на
буферном растворе добавляют 0,1-1% Triton X-100 или сапонин. Более
целесообразно использовать мелкие образцы тканей, что также сократит время
пропиток при заключении в парафин. Для гибридизации in situ пригодны
парафиновые срезы толщиной 4-14 мкм. Лучшей сохранности РНК удается
достичь при использовании замороженных срезов с последующей фиксацией в
4% PFA или в спиртовых растворах. Монослой клеток фиксируют в 4% PFA на
1х PBS или 2% PFA-метаноле (Таблица 2.1) с последующей пермеабилизацией в
0,5% Triton X-100, пропиткой 20% глицерином и многократной заморозкой в
жидком азоте и разморозкой. Для приготовления препаратов метафазных
хромосом клеточную суспензию фиксируют в метанол-ЛУК (3:1), раскапывают
на чистые охлажденные предметные стекла, но без последующего обжига в
пламени горелки (как для дифференциального окрашивания флуоресцентными
красителями, протокол 2.4.1). Если инкубация в гипотоническом растворе не
позволила полностью избавиться от клеточного детрита – возможна
кратковременная (1 – 3 сек) отмывка свежераскапанного препарата в 70% ЛУК с
последующим высушиванием на воздухе.
Протокол 2.6.2. Получение препаратов метафазных хромосом из культуры
клеток фибробластов
Концентрированный раствор колхицина: 1% водный раствор
Гипотонический раствор: 0,5% KCl или 0,9% цитрат Na (рекомендуется для
эмбриональных фибробластов)
Фиксатор: метанол-ЛУК (3:1), охлажденный до –20
о
С
1. За 35-120 мин до окончания культивирования ввести в среду колхицин
до 0,1%. Интенсивно взболтать и слить делящиеся (не распластанные)
клетки в центрифужную пробирку.
2. Собрать клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин и
инкубировать в гипотоническом растворе, согретом до 37
о
С 20-30 мин.
3. Добавить 100 мкл фиксатора в пробирку с гипотоническим раствором и
собрать клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 30
- 31
- 32
- 33
- 34
- …
- следующая ›
- последняя »
