Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 34 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 31
Протокол 2.6.4. Предобработка препаратов РНКазой А
Свободная от ДНКазы РНКаза А: 20 мг/мл в 10мМ Tris-HCl (pH 7,5); 15мМ
NaCl, инкубировать при 90
о
С в течение 15 мин, расфасовать и хранить
при –20
о
С.
Рабочий раствор РНКазы: 100 мкг/мл в 2х SSC, готовить перед
использованием.
1. Сухие препараты размочить в 2х SSC в течение 5-20 мин при комнатной
температуре.
2. Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора РНКазы, закрыть кусочком
парафильма 24х50мм
2
и инкубировать во влажной камере 1 час при 37
о
С.
3. Промыть в 3 сменах 2х SSC при комнатной температуре.
Удаление белков, маскирующих нуклеиновые кислоты, существенно
улучшает качество гибридизации на срезах тканей, монослое клеток,
препаратах митотических хромосом и интерфазных ядер. Для этой цели
используют пепсин (Протокол 2.6.5), протеиназу К (Протокол 2.6.6), а также
некоторые специфические ферменты, необходимые, например, для
переваривания хитина или целлюлозы.
Протокол 2.6.5. Предобработка препаратов пепсином
Концентрированный раствор пепсина: 10% в
стерильной воде, прокипятить
15 мин, охладить до комнатной температуры и расфасовать, хранить при
–20
о
С.
Рабочий раствор пепсина: 0,005% в 0,1М HCl.
Раствор для отмывки: 1хPBS; 50мМ MgCl
2
1. Сухие препараты размочить в 2х SSC в течение 5-20 мин при комнатной
температуре.
2. Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора пепсина, закрыть кусочком
парафильма 24х50мм
2
и инкубировать во влажной камере 10 мин при
37
о
С.
3. Промыть в 3 сменах по 5 мин 1х PBS; 50мМ MgCl
2
Протокол 2.6.6. Предобработка препаратов протеиназой К
Концентрированный раствор протеиназы К: 20 мг/мл в стерильной воде,
инкубировать 2 часа при 37
о
С, расфасовать и хранить при –20
о
С.
Рабочий раствор протеиназы К: 2 мкг/мл протеиназы К в 2 мМ CaCl
2
; 20мМ
Tris-HCl (pH 7,5).
1. Сухие препараты размочить в 2х SSC в течение 5-20 мин при комнатной
температуре.
2. Нанести на стекло 200 мкл рабочего раствора протеиназы К, закрыть
кусочком парафильма 24х50мм
2
и инкубировать во влажной камере 10
мин при 37
о
С.
3. Промыть в 3 сменах 1х PBS; 50мМ MgCl
2
по 5 мин.
После проведения любых ферментативных предобработок препарат
необходимо дополнительно зафиксировать (Протокол 2.6.7). Это позволит не

Страницы