Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 33
имеют высокое удельное включение модифицированных предшественников, а,
кроме того, позволяют легко удалять с препарата несвязавшиеся однонитевые
молекулы РНК простым перевариванием РНКазой А. Однако они
чувствительны к действию РНКаз на всех этапах гибридизации, что
накладывает дополнительные требования при работе с ними.
Легко проникают внутрь любых образцов и устойчивы к действию РНКаз
синтетические олигонуклеотидные пробы, но работать с ними приходится при
низких температурах, иначе есть риск полностью отмыть весь зонд с препарата.
Практически не имеют недостатков PNA зонды, они устойчивы к любым
ферментам, не требуют денатурации, легко проникают в ткани, а также
обладают способностью взаимодействовать с двунитевой ДНК на препарате,
комплементарно связываясь с одной нитью ДНК и вытесняя другую, что делает
ненужным предварительную денатурацию ДНК образца. Однако такие зонды
нельзя получать и метить в лабораторных условиях, а заказ и приобретение их у
фирм-изготовителей требует существенных материальных затрат.
Определившись с типом зонда и выбрав подходящую метку, необходимо
произвести включение меченого предшественника в состав зонда. Самым
дешевым методом, позволяющим пометить любую двунитевую ДНК, является
метод ник-трансляции (Протокол 2.6.8). Поскольку процесс мечения
определяется одновременной работой двух ферментов – ДНКазы I, наносящей
однонитевые разрывы, и ДНК полимеразы I, обладающей 5’–3’ экзонуклеазной
и полимеразной активностями, успех мечения в значительной степени зависит
от качества очистки исходной ДНК.
Протокол 2.6.8. Мечение ДНК-зондов методом ник-трансляции
10х буфер NT: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 50мМ MgCl
2
; 0,5 мг/мл БСА.
100мМ бета-меркаптоэтанол: 0,1 мл бета-меркаптоэтанола растворить в 1,4 мл
бидистиллированной воды.
Смесь нуклеотидов: 0,5мМ dATP, 0,5мМ dCTP, 0,5мМ dGTP и 0,1мМ dTTP.
Концентрированный раствор ДНКазы I: 1 мг/мл, растворить 1 мг в 0,5 мл
0,3М NaCl, добавить 0,5 мл глицерина, разделить на порции и хранить
при –20
о
С.
Рабочий раствор ДНКазыI: 1 мкг/мл в воде, готовят непосредственно перед
использованием (концентрацию фермента в рабочем растворе лучше
подобрать заранее, см протокол 2.6.9.).
Останавливающий реакцию раствор: 0,1М NaCl; 20мМ ЭДТА; 20мМ Tris-
HCl (pH 7,5).
1. В центрифужной микропробирке собрать реакционную смесь:
1 мкг ДНК
5 мкл 0,1М бета-меркаптоэтанола
5 мкл смеси нуклеотидов
5 мкл 10х буфера NT
1 мкл 1мМ меченого dUTP
H
2
O до 48 мкл
2. Быстро перемешать на вортексе и поставить в лед.
3. Добавить 1 мкл ДНК полимеразы I (5 единиц) и 1 мкл рабочего раствора
ДНКазы I, быстро перемешать и собрать смесь кратковременным
центрифугированием.
4. Инкубировать 90 мин при 15
о
С.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 34
- 35
- 36
- 37
- 38
- …
- следующая ›
- последняя »
