Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 37 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 34
5. Отобрать 10 мкл реакционной смеси для исследования методом
электрофореза в 1,2% агарозном геле, остальную смесь поставить в лед.
6. Если длина фрагментов больше 1000 п.н., то продолжить инкубировать
при 15
о
С еще 30 мин.
7. Остановить реакцию добавлением равного объема (40 мкл)
останавливающего буфера.
8. Добавить в реакционную смесь ДНК носитель (количество носителя и
его выбор зависит целей эксперимента и будет описан ниже) и 1/10
объёма 3М ацетата натрия, рН-5,5.
9. Добавить 2,5 объема этанола и хранить при –20
о
С до использования
(осаждать в этаноле как минимум в течение ночи).
10. Перед использованием осадить ДНК центрифугированием при 12000g в
течение 15 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением, 4
о
С).
11. Промыть осадок 70% этанолом и подсушить.
Для ускорения мечения и уверенного получения фрагментов необходимого
размера концентрацию ДНКазы I в рабочем растворе необходимо подобрать
заранее, руководствуясь следующим протоколом (2.6.9).
Протокол 2.6.9. Оптимизация размеров меченых фрагментов
10х буфер NT: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 50мМ MgCl
2
; 0,5 мг/мл БСА.
100мМ бета-меркаптоэтанол: 0,1 мл бета-меркаптоэтанола растворить в 1,4 мл
бидистиллированной воды.
Смесь нуклеотидов: 0,5мМ dATP, 0,5мМ dCTP, 0,5мМ dGTP и 0,5мМ dTTP.
Концентрированный раствор ДНКазы I: 1 мг/мл, растворить 1 мг в 0,5мл
0,3М NaCl, добавить 0,5 мл глицерина, разделить на порции и хранить
при –20
о
С.
Рабочий раствор ДНКазыI: приготовить серию разведений от 0,1 мкг/мл до 10
мкг/мл в воде.
Останавливающий реакцию раствор: 0,1М NaCl; 20мМ ЭДТА; 20мМ Tris-
HCl (pH 7,5).
1. В центрифужных микропробирках собрать реакционную смесь:
1 мкг ДНК
5 мкл 0,1М бета-меркаптоэтанола
5 мкл смеси нуклеотидов
5 мкл 10х буфера NT
H
2
O до 48 мкл
2. Быстро перемешать на вортексе и поставить в лед.
3. Добавить 1 мкл ДНК полимеразы I (5 единиц) и по 1 мкл каждого
рабочего раствора ДНКазы I, быстро перемешать и собрать смесь
кратковременным центрифугированием.
4. Инкубировать 90 мин при 15
о
С.
5. Отобрать 10 мкл реакционной смеси для исследования методом
электрофореза в 1,2% агарозном геле с маркерами размера ДНК от 50 до
2000 п.н.
6. Зафиксировать оптимальную концентрацию рабочего раствора, дающую
фрагменты от 100 о 500 п.н., и использовать ее в дальнейшем.

Страницы