Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 39 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 36
образующие шпилек и не комплементарные друг другу. При использовании в
качестве матрицы геномной ДНК рекомендуется до реакции мечения получить
первичный амплификат и убедиться, что его длина соответствует
предполагаемой. В том случае, если необходимо получить зонд для
клонированного фрагмента неизвестной нуклеотидной последовательности,
можно воспользоваться стандартными праймерами, фланкирующими
полилинкерный участок вектора. Однако необходимо помнить, что наилучший
результат получается при использовании зондов длиной 200-700 п.н., при этом
допустимо использование последовательностей до 1000 п.н., но если
клонированный фрагмент длиннее, его придется разрезать ДНКазой I. Для этого
готовят раствор 1,5 мкг/мл ДНКазы; 0,1M MgCl
2
и добавляют прямо в
реакционную смесь в таком количестве, чтобы после 10-15 мин инкубации в
растворе были фрагменты длиной 200-500 п.н. Ингибируют ДНКазу
прогреванием в течение 2-3 мин при 94
о
С.
Протокол 2.6.11. Мечение зондов методом ПЦР
10х буфер для Taq полимеразы: 0,1М Tris-HCl (pH 8,4); 0,5М KCl; 25мМ
MgCl
2
(лучше использовать буфер, рекомендованный производителем
полимеразы, концентрация MgCl
2
может быть от 15мМ до 25мМ)
10х раствор прямого праймера: 10 мкМ.
10х раствор обратного праймера: 10 мкМ.
10х смесь нуклеотидов: 2мМ dATP; 2мМ dCTP; 2мМ dGTP; 1,3мМ dTTP.
Меченый предшественник: 1мМ меченый dUTP.
1. Собрать реакционную смесь в тонкостенной микропробирке для ПЦР:
2 мкл 10х буфера
2 мкл 10х смеси нуклеотидов
1,4 мкл 1мМ меченого dUTP
2 мкл раствора прямого праймера
2 мкл раствора обратного праймера
1 единицу Taq ДНК полимеразы
0,1 мкг ДНК матрицы
Н
2
О до 20 мкл
2. Быстро перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным
центрифугированием.
3. При необходимости наслоить минеральное масло (если термоциклер
оборудован нагревающейся крышкой – эта процедура не нужна).
4. Инкубировать в термоциклере по следующей программе:
денатурация 94
о
С 1 – 5 мин
денатурация 94
о
С 30 – 60 сек
отжиг 50-65
о
С 30 – 90 сек 30 циклов
синтез 68-72
о
С 1 – 3-мин
синтез 68-72
о
С 4 – 7 мин
Температура отжига зависит от длины и состава праймеров.
Температура синтеза зависит от используемой полимеразы.

Страницы