Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 37
5. Отобрать 0,5 – 1 мкл реакционной смеси для исследования методом
электрофореза в 1% агарозном геле.
Включение dUTP, меченных некоторыми флуорохромами, требует уменьшения
доли модифицированного нуклеотида и соответственно увеличения доли dTTP в
реакционной смеси. Конечная концентрация некоторых конъюгатов:
DEAC – dUTP 20мкМ
Родамин 6G – dUTP 30мкМ
TAMRA – dUTP 30мкМ
Техасский красный – dUTP 30мкМ
Cy3 – dUTP 50мкМ
Cy5 – dUTP 50мкМ
AMCA – dUTP 60мкМ
FITC – dUTP 60мкМ
Очистить полученный зонд от минерального масла, а также избавиться от
невключившихся нуклеотидов можно переосаждением амплификата
изопропанолом (Протокол 2.6.12).
Протокол 2.6.12. Очистка ПЦР продукта
Хлороформ – изоамиловый спирт: Смешать хлороформ и изоамиловый спирт
в соотношении 24:1.
1. Довести объем реакционной смеси водой до 100 мкл.
2. Добавить равный объем (100 мкл) хлороформ – изоамилового спирта,
встряхнуть и отцентрифугировать 2 мин при 3000g.
3. Аккуратно собрать водную (верхнюю) фазу в новую пробирку.
4. Добавить 1/4 объема (25 мкл) 10М ацетата аммония и перемешать.
5. Добавить равный объем изопропанола (125 мкл) и инкубировать 10 мин
при комнатной температуре.
6. Осадить ДНК центрифугированием при 12000g в течение 15 мин и
промыть осадок охлажденным 70% этанолом.
Использование ПЦР с вырожденными праймерами (DOP-ПЦР) позволяет
метить любые последовательности ДНК достаточно эффективно (Протокол
2.6.13), причем, имея даже незначительное число копий исходной ДНК-
матрицы, мы можем получить неограниченное количество меченого зонда.
Метод основан на использовании праймеров, внутренняя последовательность
которых состоит из 6 случайных нуклеотидов: 5’-
CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’. Сначала проводят несколько
низкотемпературных циклов, позволяющих праймерам фланкировать участки
ДНК матрицы, причем, варьируя условия первых циклов можно задавать
специфичность отжига и длину полученных фрагментов. В следующих
высокотемпературных циклах полученные фланкированные
последовательности амплифицируются по стандартному протоколу ПЦР.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 38
- 39
- 40
- 41
- 42
- …
- следующая ›
- последняя »
