Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 41 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 38
Протокол 2.6.13. Использование вырожденных праймеров для получения
первичного амплификата (DOP-ПЦР)
10х буфер для Hot-Taq полимеразы: 0,1М Tris-HCl (pH 8,4); 0,5М KCl; 25мМ
MgCl
2
(лучше использовать буфер, рекомендованный производителем
полимеразы, концентрация MgCl
2
может быть от 15мМ до 25мМ)
10х раствор универсального вырожденного праймера: 20мкМ.
10х смесь нуклеотидов: 2мМ dATP; 2мМ dCTP; 2мМ dGTP; 2мМ dTTP.
1. Собрать реакционную смесь в тонкостенной микропробирке для ПЦР:
2 мкл 10х буфера
2 мкл 10х смеси нуклеотидов
2 мкл 10х раствора праймеров
1 единицу Hot-Taq ДНК полимеразы
0,1-1 нг ДНК матрицы
Н
2
О до 20 мкл
2. Быстро перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным
центрифугированием, при необходимости наслоить минеральное масло.
3. Инкубировать в термоциклере по следующей программе:
денатурация 94
о
С 10 мин
денатурация 94
о
С 1 мин
отжиг 30
о
С 1,5 мин 5-8
медленный нагрев до 72
о
С 3 мин циклов
синтез 72
о
С 3-мин
денатурация 94
о
С 1 мин
отжиг 56
о
С 1 мин 30 циклов
синтез 72
о
С 1,5-мин
в каждом цикле увеличивая время синтеза на 1 сек
синтез 72
о
С 10 мин
4. Отобрать 5-10 мкл реакционной смеси для исследования методом
электрофореза в 0,7–1% агарозном геле.
В том случае, когда реакцию проводят с использованием других типов
термостабильных полимераз, не выдерживающих длительного нагревания до
94
о
С, полимеразу в реакционную смесь добавляют после этапа первой
длительной денатурации. Меченый предшественник вводится в реакцию только
после проверки длины первичного амплификата. 1-10 мкл исходного ПЦР
продукта берут в реакцию мечения и проводят ее только с использованием
высокотемпературных циклов. Доля модифицированного предшественника в
составе реакционной смеси зависит от типа конъюгата (Протокол 2.6.11).
Однонитевые РНК зонды получают методом транскрипции in vitro
(Протокол 2.6.14). Для этого используются векторы с промоторами для
различных фаговых РНК-полимераз, причем наличие разных промоторов по
обеим сторонам клонированного фрагмента позволяет получать однонитевые
зонды, комплементарные как смысловой, так и несмысловой
последовательности. Это дает возможность осуществления контрольного
эксперимента. Чтобы исключить получение длинных последовательностей,

Страницы