Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 40
Протокол 2.6.15. Оценка эффективности мечения зонда
Инкубационный буфер: 0,1M Tris-HCl (pH 7,5); 0,1M NaCl; 2мМ MgCl
2
; 0,05%
Triton X-100.
Блокирующий реагент: 3% БСА на инкубационном буфере.
Буфер для щелочной фосфатазы: 0,1M Tris-HCl (pH 9,5); 0,1M NaCl; 50мМ
MgCl
2
.
Концентрированный раствор NBT (нитротетразолий синий): 75 мг/мл в
диметилформамиде.
Концентрированный раствор BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат): 50
мг/мл в 50% диметилформамиде (при использовании калиевой соли
BCIP) или воде (при использовании натриевой соли BCIP).
Раствор для детекции: непосредственно перед использованием к 10 мл буфера
для щелочной фосфатазы добавить 44 мкл концентрированного раствора
NBT и 33 мкл концентрированного раствора BCIP, беречь от света.
1. Приготовить в лунках иммунологического планшета серию разведений
зонда от 1 нг/мкл до 0,1 пг/мкл. Для этого нанести в лунки
иммунологического планшета по 9 мкл дистиллированной воды, а для
первого разведения 9,5 мкл. Добавить к первой капле 0,5 мкл раствора
меченого зонда, аккуратно перемешать пипетированием; затем из первой
капли перенести 1 мкл во вторую каплю и так до последней лунки.
2. По 1 мкл из каждого разведения нанести на нейлоновую мембрану и
высушить.
3. Облучить мембрану УФ в течение 2-3 мин.
4. Смочить мембрану в инкубационном буфере.
5. Перенести мембрану в емкость с блокирующим раствором и
инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
6. Провести иммунохимическую реакцию: для биотинилированных зондов
используют стрептавидин, конъюгированный с щелочной фосфатазой,
разведенный в инкубационном буфере 1:1000 – 1:5000; для зондов,
меченных дигоксигенином, используют антитела против дигоксигенина,
конъюгированные с щелочной фосфатазой, разведенные в
инкубационном буфере 1:500 – 1:1000. Мембрану инкубируют в растворе
антител в течение 30 мин при 37
о
С.
7. Отмыть мембрану в 3 сменах инкубационного буфера по 5 мин при
комнатной температуре и постоянном покачивании.
8. Перенести мембрану на 1 мин в буфер для щелочной фосфатазы.
9. Инкубировать мембрану в растворе для детекции в течении 1-3 часов в
темноте при комнатной температуре.
10. Хорошо промыть мембрану проточной водой и высушить.
Зонд можно использовать для гибридизации, если на мембране выявляется
точка, содержащая 1 пг меченой ДНК, для высокоповторяющихся
последовательностей ДНК выявление 5 пг зонда можно считать достаточным.
Количество меченого зонда, необходимое для проведения одной
гибридизации, зависит не только от удельного включения модифицированного
предшественника, но и от состава исследуемой последовательности. При этом
одновременно надо учитывать, что для создания условий благоприятствующих
выходу денатурированного зонда из раствора и образованию гибридных
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 41
- 42
- 43
- 44
- 45
- …
- следующая ›
- последняя »
