Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 42
протоколу. ДНК лучше растворяется в формамиде, чем в водных растворах,
поэтому начинать приготовление пробы целесообразно с добавления
формамида к сухому осадку.
Кроме температуры, на процесс ренатурации оказывают влияние
кислотность раствора и концентрация одновалентных катионов. Повышение pH
до 10 и выше приводит к нарушению стабилизации дуплексов, что увеличивает
жесткость условий гибридизации. Поэтому в основе гибридизационной смеси
обычно лежит буферный раствор с pH 6,5 – 7,5. Концентрация одновалентных
катионов, таких как ионы натрия, оказывает еще более существенное влияние
на стабилизацию гибридов. Положительно заряженные катионы
взаимодействуют с фосфатными группами нуклеиновых кислот, снижая
электростатическое отталкивание двух комплементарных нитей. Поэтому
увеличение концентрации солей одновалентных металлов снижает жесткость
гибридизации. Эти факторы надо учитывать при выборе гибридизационного
буфера для постановки конкретного эксперимента. Стандартная
гибридизационная смесь для фрагментов длиной 200-700 н.п. содержит 2х SSC
pH 7,0, тогда как для межвидовой гибридизации и олигонуклеотидных зондов
используют буфер на основе 4х SSC.
Для того, чтобы гибридизационную смесь можно было нанести на препарат
и заключить под покровное стекло, ее объем должен быть не меньше 10 мкл для
покровных стекол 22х22мм
2
и 20 мкл – для стекол 22х50мм
2
. В таком объеме
трудно достичь концентрации зонда, эффективно образующего гибриды с
молекулами на препарате. Решить эту задачу позволяют вещества, связывающие
воду и увеличивающие эффективную концентрацию зонда, такие как декстран
сульфат с молекулярным весом выше 8000 (лучше 200000). Конечная
концентрация декстран сульфата в гибридизационном буфере составляет 5-10%.
Протокол 2.6.16. Растворение зонда в гибридизационном буфере
Деионизированный формамид: к 100 мл формамида добавить 10 г
ионообменной смолы с размером ячейки 20-50 (AG501-X8, Bio-Rad),
инкубировать 1-3 часа при комнатной температуре, перемешивая смесь
на магнитной мешалке. Затем дважды профильтровать смесь через
бумажный фильтр Ватман № 1, расфасовать и хранить при –20
о
С.
Концентрированный гибридизационный буфер: 4х SSC, 20% декстран
сульфат; растворить навеску декстран сульфата в воде, прокипятить на
водяной бане или проавтоклавировать, добавить 20х SSC до
необходимой концентрации и профильтровать через мембрану с
диаметром пор не меньше 0,45 мкм, расфасовать и хранить при –20
о
С,
перед использованием тщательно перемешивать.
1. Осажденный спиртом меченый зонд вместе с носителем промыть
холодным 70% этанолом, отцентрифугировать при 12000g в течение 10
мин при 4
о
С и подсушить.
2. Растворить в деионизированном формамиде (в половине конечного
объема пробы, так чтобы получить гибридизационную смесь с 50%
формамида).
3. Добавить равный объем концентрированного гибридизационного буфера
и тщательно перемешать на вортексе.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 43
- 44
- 45
- 46
- 47
- …
- следующая ›
- последняя »
