Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 44
Протокол 2.6.17. Отмывка препаратов после гибридизации
1. Аккуратно снять пинцетом резиновый клей.
2. Поместить стекла в стаканчик с 50% формамидом, 2х SSC,
предварительно нагретым до 42
о
С и подождать, пока покровные стекла
съедут с препаратов.
3. Дважды отмыть препараты в 50% формамиде, 2х SSC при 42
о
С по 5 мин,
постоянно покачивая.
4. Дважды отмыть препараты в 1х SSC при 42
о
С по 5 мин, постоянно
покачивая.
При проведении прямой гибридизации с зондами, непосредственно
меченными флуорохромами, после отмывки препарат проводят по серии
спиртов повышающихся концентраций, высушивают на воздухе, заключают в
фотозащитную среду и исследуют под микроскопом. Все работы с
флуорохромами по возможности проводят в темноте.
В том случае, когда зонд требует иммунохимического выявления, ее
проводят сразу после отмывок, избегая высушивания препарата, так как это
может ухудшить результат детекции (Протокол 2.6.18). Будучи по существу
иммуноцитохимическим окрашиванием, детекция может быть прямой, если
антитела к использованным гаптенам непосредственно конъюгированы с
флуорохромом, и непрямой, когда распознающие метку иммуноглобулины
требуют дополнительного этапа детекции антителами, конъюгированными с
флуорохромами.
Протокол 2.6.18. Иммунохимическая детекция гибридизовавшегося зонда
Раствор для отмывок: 4х SSC; 0,1% Tween 20
Блокирующий раствор 3% БСА в 4х SSC; 0,1% Tween 20
Раствор для разведения антител: 1% БСА на 4х SSC, 0,1% Tween 20
Развести антитела в соответствии с рекомендациями производителей.
1. На отмытые после гибридизации препараты нанести по 500 мкл
блокирующего раствора, накрыть кусочками парафильма 24х50мм
2
,
поставить во влажную камеру и инкубировать 30 – 60 мин при 37
о
С.
2. Стряхнуть блокирующий раствор вместе с парафильмом.
3. Нанести 200мкл раствора антител и накрыть новым кусочком
парафильма, инкубировать во влажной камере 40 – 60 мин при 37
о
С.
4. Отмывать в 4 сменах 4х SSC; 0,1% Tween 20 по 5 мин при 37
о
С,
непрерывно качая.
При использовании двух и более антител, пункты 3 и 4 повторяют необходимое
количество раз. Больше 5 этапов окрашивания проводить не рекомендуется,
поскольку из-за многократно увеличенного неспецифического связывания
полученные результаты будет трудно интерпретировать. Все этапы по
возможности проводить в темноте.
После завершения детекции препарат рекомендуется провести по серии
спиртов повышающихся концентраций и высушить на воздухе. Это
обеспечивает дополнительную фиксацию материала, подвергшегося обработке
растворами детергента, а также удаляет мыльные разводы с препарата, которые
могут ухудшить качество изображений. Однако дегидратируя препарат
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 45
- 46
- 47
- 48
- 49
- …
- следующая ›
- последняя »
