Составители:
Рубрика:
Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 46
менее, даже усиленный иммунохимическими методами сигнал позволяет
локализовать последовательности не меньше 5 т.п.н., а в том случае, когда
необходимо локализовать единичные копии уникальных последовательностей
ДНК или РНК-транскриптов придется прибегнуть к усилению сигнала с
использованием меченых тирамид. В основе метода лежит каталитическая
доставка репортерных молекул (catalyzed reporter deposition, CARD), которая
широко используется в иммуноблоттинге и иммуносорбентном методе со
связанным ферментом (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). В такой
системе визуализация сигнала происходит в результате пероксидазно-
тирамидной реакции в участке связывания пероксидазы хрена, обогащенном
тирозином, фенилаланином и триптофаном, приводя к накоплению
активизированных тирамид в местах локализации пероксидазы на препарате
(Рисунок 2.4). Причем тирамиды могут быть как гаптенизированными, то есть
требовать последующего иммунохомического выявления, так и
непосредственно конъюгированными с флуорохромами. При этом
чувствительность метода возрастает настолько, что удается детектировать 1 – 20
копий мРНК на клетку.
тирамиды, конъюгированные с флуорохромами
.
активизированные тирамиды
анти-дигоксигенин, конъюгированный с пероксидазой хрена
дигоксигенин
гибрид зонда и нуклеиновой кислоты на препарате
Рисунок 2.4. Схема усиления сигнала с использованием меченых тирамид.
При необходимости одновременной локализации на препарате нескольких
последовательностей проводят гибридизацию с зондами, меченными разными
репортерными молекулами, детектируемыми различными флуорохромами.
Чаще всего для детекции многоцветной FISH
используют следующие
флуорохромы: AMCA; DEAC; FITC; Alexa 488; Cy3; TRITC; Cy3,5; Техасский
красный; Alexa 633; Cy5; Cy5,5 - подбирая комбинации флуорохромов с
неперекрывающимися спектрами излучения. В случае проведения прямой
гибридизации меченные флуорохромами предшественники непосредственно
включаются в состав зонда, при проведении непрямой FISH используются
зонды, меченные разными гаптенами, такими как: биотин, дигоксигенин,
динитрофенол, эстрадиол, которые детектируются иммунохимическими
методами, причем детекцию гаптенов можно проводить одновременно. Так,
например, для одновременной детекции биотина и дигоксигенина препарат
инкубируют в растворе, содержащем авидин-FITC и анти-дигоксигенин-Cy3, в
соответствующих разведениях. При необходимости одновременной детекции
третьего зонда, например меченного динитрофенолом, в тот же раствор можно
ввести антитела против динитрофенола, конъюгированные с DEAC.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 47
- 48
- 49
- 50
- 51
- …
- следующая ›
- последняя »
