Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 47
Планируя эксперимент необходимо учесть, что для локализации трех
последовательностей достаточно использовать две различные репортерные
системы. То есть первый зонд детектируется флуорохромом 1, второй зонд –
флуорохромом 2, а третий зонд – одновременно флуорохромами 1 и 2. Такой
подход не только снижает стоимость эксперимента, но и позволяет получать
более четкие результаты, поскольку увеличение числа флуорохромов приводит
к тому, что возникает проблема частичного перекрывания спектров. Число
различных последовательностей, которые одновременно можно локализовать на
препарате, равно 2
n
-1, где n – число использованных флуорохромов. Так, имея 3
репортерных молекулы, мы можем получить 7 различных зондов.
При наличии в комплектации микроскопа узкополосных фильтров можно
использовать одновременно и большее количество зондов. Так использование
пяти флуорохромов (например, AMCA, FITC, Cy3, Cy5, Cy7) дает возможность
создать 31 независимый зонд. Классическая схема M-FISH, позволяющая
идентифицировать все хромосомы человека, основана на одновременном
использовании 6 флуорохромов (Таблица 2.2).
Таблица 2.2. Схема M-FISH на хромосомах человека с 6 флуорохромами
зонд
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
DEAC Х Х Х Х Х Х Х Х Х
FITC Х Х Х Х Х Х Х Х
Cy3 Х Х Х Х Х Х
Cy3,5 Х Х Х Х Х Х Х Х
Cy5 Х Х Х Х Х Х Х
Cy5,5 Х Х Х Х Х Х Х
Другой способ обойти проблему перекрывающихся спектров – проведение
нескольких последовательных гибридизаций на одном препарате с
промежуточными фиксациями изображений и отмывками. Такой метод получил
название репробинга. Он позволяет, используя ограниченное число
флуорохромов, локализовать достаточно много различных
последовательностей. Ниже приведена схема эксперимента для идентификации
всех хромосом человека с использованием всего трех флуорохромов (Таблица
2.3).
Таблица 2.3. Схема идентификации хромосом человека методом
репробинга с 3 флуорохромами
зонд
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Первая гибридизация
TAMRA
Х Х Х Х Х Х Х Х Х
FITC Х Х Х Х Х Х Х Х
Cy5 Х Х Х Х Х Х
Вторая гибридизация
TAMRA
Х Х Х Х Х Х Х Х
FITC Х Х Х Х Х Х Х Х
Cy5 Х Х Х Х Х Х
При необходимости, гибридизацию in situ можно сочетать с другими
методами исследования. Иммуноцитохимическое окрашивание белков проводят
либо до гибридизации, либо после нее, вместе с детекцией гаптенов, в
зависимости от чувствительности эпитопов к высушиванию.
Также метод FISH можно сочетать с включением галогенизированных
предшественников. Само мечение проводят инкубацией клеток культуры в
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 48
- 49
- 50
- 51
- 52
- …
- следующая ›
- последняя »
