Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 43
Двунитевые зонды требуют обязательной предварительной денатурации
непосредственно перед нанесением на препарат. Для этого пробирку с
подготовленным зондом кипятят на водяной бане в течение 5 мин. Если зонд не
требует предварительного отжига с носителем, сразу после денатурации его
переносят в лед и инкубируют при 0
о
С в течение 5–10 мин. При работе с
зондами к отдельным хромосомным сегментам, хромосомными пэйнтами, а
также для проведения CGH, меченую последовательность предварительно
отжигают с конкурентной ДНК. Для этого подготовленную пробу сразу после
денатурации инкубируют при комнатной температуре или при 37
о
С в течение 5-
30 мин и только после этого наносят на препарат.
В некоторых случаях, если объект исследования имеет значительный объем
или трудно пропитывается растворами, целесообразно перед нанесением зонда
провести предгибридизацию с гибридизационным буфером того же состава,
только без меченого зонда.
Денатурацию нуклеиновых кислот на препарате можно провести
предварительно, как описано в протоколе 2.5.2. Этим же способом придется
воспользоваться при осуществлении гибридизации с зондом, требующим
предварительного отжига с конкурентной ДНК. Если же такой необходимости
нет, гораздо эффективнее провести денатурацию в гибридизационном буфере.
10 мкл гибридизационной смеси аккуратно заключить под покровное стекло
22х22мм
2
или 20 мкл – под стекло 24х50мм
2
, стараясь не оставлять пузырей,
заклеить по периметру резиновым клеем на основе каучука и прогреть препарат
до 81,5
о
С в течение 2 – 3 мин.
На предварительно денатурированный препарат точно так же наносят зонд,
закрывают покровным стеклом и заклеивают резиновым клеем.
Гибридизацию проводят при температуре 37
о
– 42
о
С во влажной камере в
течение 1–2 суток. При более кратковременной инкубации снижается
эффективность гибридизации, тогда как длительные эксперименты
протяженностью более трех суток не показывают заметного усиления сигнала
по сравнению с двухдневными гибридизациями, но при этом возрастает риск
заражения бактериями и грибами.
После завершения инкубации препараты необходимо отмыть от молекул
зонда, не вступивших в комплементарное взаимодействие с нуклеиновыми
кислотами на препарате (Протокол 2.6.17). Жесткость отмывок, также как и
условий гибридизации, определяется температурой и концентрацией
одновалентных катионов. Температурный режим можно также изменять
добавлением формамида, поскольку его присутствие снижает температуру
плавления дуплексов, причем увеличение содержания формамида на 2%
приводит к уменьшению температуры денатурации на 1
о
. Концентрацию солей
изменяют, варьируя кратность буферного раствора SSC в составе растворов для
отмывки. Рекомендуется смывать покровное стекло и проводить первую
отмывку в буфере того же состава, что и гибридизационный, только
температуру увеличивают на 5–10
о
С. Следующую отмывку проводят в 2 сменах
буфера без формамида, а ее жесткость регулируют температурой (42
о
–65
о
С) и
кратностью буфера (0,1хSSC – 2хSSC).
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 44
- 45
- 46
- 47
- 48
- …
- следующая ›
- последняя »
