Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 42 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 39
содержащих не только клонированный фрагмент, вектор разрезают
рестриктазой по сайту, находящемуся сразу за вставкой, после чего линейную
последовательность проверяют методом электрофореза и дважды очищают
фенол-хлороформом. Очищенный линейный вектор переосаждают спиртом и
растворяют в 10мМ Tris-HCl (pH 8,0); 1мМ ЭДТА. Метить РНК можно
непосредственно предшественником, несущим репортерную молекулу, но
эффективность включения выше при использовании смеси UTP и аминоаллил-
UTP (1:1), с последующим присоединением биотина к уже синтезированной
молекуле РНК.
Протокол 2.6.14. Получение меченых РНК зондов
РНК полимеразы: T3, T7 или SP6.
10х Т3,Т7 буфер: 200мМ Tris-HCl (pH 8,0); 40мМ MgCl
2
, 10мМ спермидин;
250мМ NaCl.
10х SP6 буфер: 200мМ Tris-HCl (pH 7,5); 30мМ MgCl
2
; 10мМ спермидин.
Смесь нуклеотидов: 10мМ АТР; 10мМ СТР; 10мМ GTP; 7,5мМ ТТР.
Меченый предшественник: 1мМ меченый UTP
1. Собрать реакционную смесь:
2 мкл 10х буфера
1 мкл смеси нуклеотидов
1 мкл меченого UTP
1 единица РНКазина
1 мкг линейной ДНК матрицы
10 единиц РНК полимеразы
H
2
O до 20 мкл
2. Быстро перемешать на вортексе и собрать смесь кратковременным
центрифугированием.
3. Инкубировать при 37
о
С (Т3 и Т7) или 40
о
С (SP6) в течение 2 часов.
4. Добавить 10 единиц ДНКазы, свободной от РНКазы, и инкубировать при
37
о
С 15 мин.
5. Остановить реакцию добавлением 2 мкл 200мМ ЭДТА
6. Добавить РНК носитель - 1 мкг дрожжевой тРНК и 5 мкл 5М ацетата
аммония.
7. Осадить РНК добавлением 2,5 объемов охлажденного этанола.
Инкубировать при -20
о
С в течение ночи.
8. Собрать осадок центрифугированием при 12000g в течение 20 мин при
4
о
С и промыть осадок охлажденным 70% этанолом.
Эффективность включения меченного гаптенами предшественника можно
оценить иммунохимической реакцией с антителами, конъюгированными с
щелочной фосфатазой (Протокол 2.6.15).

Страницы