Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 35
Концевое мечение с использованием дезоксинуклеотидил трансферазы
применяется главным образом для включения радиоактивного предшественника
или мечения олигонуклеотидных зондов.
Метод олигомечения со случайными праймерами (Протокол 2.6.10)
основан на использовании коротких олигонуктеотидных (6 – 9 п.н.) затравок, с
равной вероятностью отжигающихся вдоль всей денатурированной молекулы
ДНК и способности фрагмента Кленова ДНК полимеразы I к 5'-3' полимеразной
активности. Он позволяет
получать зонды с большей долей включения меченого
предшественника, чем концевое мечение и ник-трансляция, но длина меченых
фрагментов может быть ограничена только длиной матрицы, что не всегда
удобно, а, кроме того, себестоимость зонда, полученного таким образом, выше.
Тем не менее, этот метод достаточно прост и пользуется популярностью.
Протокол 2.6.10. Олигомечение ДНК
со случайными праймерами
10х буфер для фрагмента Кленова: 0,5М Tris-HCl (pH 7,5); 100мМ MgCl
2
;
10мМ DTT; 0,5 мг/мл БСА; 0,5М ЭДТА (pH 8,0).
10х смесь праймеров: 1мМ раствор олигонуклеотидов (статистических
затравок).
10х смесь нуклеотидов: 1мМ dATP; 1мМ dCTP; 1мМ dGTP; 0,65мМ dTTP и
0,35мМ меченого dUTP.
1. Матричную ДНК, растворенную в воде, прокипятить на водяной бане в
течение 5 мин и быстро перенести на лед.
2. Собрать реакционную смесь:
0,5-1 мкг денатурированной ДНК
2 мкл 10х буфера
2 мкл смеси нуклеотидов
2 мкл смеси праймеров
H
2
O до 19 мкл
3. Добавить 2 мкл фрагмента Кленова (2 единицы), перемешать на вортексе
и собрать смесь кратковременным центрифугированием.
4. Инкубировать при 37
о
С от 2 до 8 часов.
5. Остановить реакцию добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА.
6. Отобрать 5-10 мкл реакционной смеси для исследования методом
электрофореза в 1,2% агарозном геле.
7. Добавить в реакционную смесь ДНК носитель (количество носителя и
его выбор зависит от целей эксперимента и будет описан ниже) и 1/10
объёма 3 М ацетата натрия, рН 5,5
8. Добавить 2,5 объема этанола и хранить при –20
о
С до использования
(осаждать в этаноле как минимум в течение ночи).
9. Перед использованием осадить ДНК центрифугированием при 12000g в
течение 15 мин (лучше использовать центрифугу с охлаждением, 4
о
С).
10. Промыть осадок 70% этанолом и подсушить.
Наиболее дешевым и вместе с тем самым эффективным методом получения
меченых ДНК зондов является метод ПЦР (Протокол 2.6.11). Кроме высокой
эффективности включения меченых нуклеотидов, этот метод позволяет
увеличить количество исходной матрицы в среднем в 10
4
раз. При
необходимости получить зонд для локализации известной последовательности
используются праймеры, находящиеся на расстоянии 100 п.н. – 1000 п.н., не
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 36
- 37
- 38
- 39
- 40
- …
- следующая ›
- последняя »
