Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 33 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов 30
4. Ресуспензировать клетки в ледяном фиксирующем растворе и оставить
на 30 мин при –20
о
С.
5. Собрать клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин,
ресуспензировать в новой порции фиксатора и оставить на 10 мин при –
20
о
С.
6. Собрать клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин,
ресуспензировать в новой порцией фиксатора и оставить на ночь при –
20
о
С.
7. Чистые сухие предметные стекла поместить в 96% этанол и охладить до
4
о
С.
8. Собрать клетки центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин,
ресуспензировать в новой порции фиксатора.
9. Промыть предметное стекло в ледяной дистиллированной воде и
раскапать на него суспензию фиксированных клеток.
10. Высушить препараты на воздухе
11. Опустить препарат в 96% этанол на 3 мин, быстро высушить и убрать в
коробочку. Хранить при –20
о
С, не позволяя обводняться.
12. Перед использованием замороженный препарат помещают в 96% этанол,
а затем высушивают.
Протокол 2.6.3. Фиксация тканей для приготовления парафиновых срезов
1. Изолированные фрагменты тканей промыть в физиологическом растворе
или 1х PBS.
2. Фиксировать материал в 4% PFA на 1х PBS 30 мин – 4 часа при 4
о
С.
3. Отмыть в 1х PBS 30 мин и провести по серии спиртов увеличивающейся
концентрации по 30 мин при 4
о
С, в 70% этаноле оставить на ночь при
4
о
С.
4. Обезводить материал в изобутиловом спирте и пропитать ксилолом, а
затем парафином.
5. Залить материал в блоки и нарезать толщиной 5 мкм.
6. Наклеить срезы на подготовленные стекла и сушить в течение ночи при
65
о
С.
Локализацию транскриптов лучше проводить сразу после приготовления
препаратов во избежание деградации РНК. Препараты для исследования ДНК
можно хранить в высушенном виде при 4
о
С или при –20
о
С несколько месяцев.
Свежеприготовленные препараты хромосом, раскапанные на чистые стекла без
адгезивов, могут отмываться в процессе предобработки или при детекции, тогда
как старые препараты практически не теряются. При необходимости
проведения срочной гибридизации препараты искусственно «состаривают»
инкубированием в сухом виде от 2 час до 1 суток при 65
о
С.
Препараты хромосом типа ламповых щеток и политенных хромосом сразу
после фиксации можно использовать для проведения гибридизации in situ. В
том случае, когда нужно избавиться от сигнала, возникшего при
взаимодействии зонда с транскриптами, проводят обработку РНКазой А
(Протокол 2.6.4). Если необходимо также исключить взаимодействие с РНК,
находящейся в составе дуплексов, проводят предобработку препаратов
РНКазой H.

Страницы