Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 27
Если необходимо локализовать несколько последовательностей на одном
препарате, возможно проведение многоцветной PRINS. В этом случае, после
каждой проведенной реакции и отмывки (Протокол 2.5.6, пункты 1-5) проводят
реакцию затупления 3’-концов (Протокол 2.5.5), при этом в каждом следующем
раунде дополнительную денатурацию проводят на препарате в течение 1 мин
при 94
о
С, а реакционные смеси будут различаться меткой, конъюгированной с
предшественником. Использование различных гаптенов потребует отдельной
иммунохимической детекции для каждого антителами, меченными
флуорохромами с неперекрывающимися спектрами флуоресценции. Когда для
реакции используют предшественники, непосредственно связанные с
флуорохромами, детекция не нужна, но чувствительность метода снижается.
Расчет доли меченого предшественника в составе реакционной смеси в
этом
случае производят в соответствии с рекомендациями производителя.
Увеличения чувствительности метода при локализации уникальных
последовательностей можно достичь использованием нескольких
однонаправленных праймеров, комплементарных участкам исследуемой
последовательности на расстоянии 200-500 п.н.
Для выявления определенных последовательностей РНК на препарате
можно использовать метод обратной транскрипции in situ (RT-PRINS)
(Протокол 2.5.7). В этом случае практически нет проблемы неспецифического
мечения, зато возможны неудачи из-за быстрой деградации РНК. Поэтому все
инструменты и посуда должны быть проавтоклавированы, а растворы
приготовлены с использованием воды без нуклеазной активности. Для
исследования лучше всего подходят свежезафиксированные препараты
замороженных срезов на покровных стеклах.
Протокол 2.5.7. Мечение РНК транскриптов in situ (RT-PRINS)
Буфер RT: 100мМ Tris-HCl (pH 8,3); 140мM KCl; 10мМ MgCl
2
; 25мМ бета-
меркаптэтанол.
Реакционная смесь: 0,5мМ dATP, dCTP, dGTP; 0,07мM dTTP и 0,08мМ
биотинилированного dUTP в буфере RT.
Блокирующий раствор: 3% БСА в 2х SSC; 0,02% Tween 20.
Детектирующий раствор: авидин, стрептавидин или антитела против биотина,
конъгированные с флуорохромом, разведенные в соответствии с
рекомендациями производителя.
1. Инкубировать препарат в 0,2М Tris-HCl (pH 7,4) с 0,1M глицина 10 мин
при комнатной температуре.
2. Перенести в 2хSSC, 50% формамид и инкубировать 10 мин при
комнатной температуре.
3. Повысить температуру до 65
о
С и инкубировать еще 10 мин при 65
о
С.
4. Отмыть в 2 сменах холодного буфера RT по 15 мин при 0
о
С.
5. Нанести 10 мкл буфера RT с 2 мкг праймеров и 0,25 единиц РНКазина,
перевернуть на предметное стекло и инкубировать 90 мин при
температуре отжига праймеров.
6. Аккуратно смыть стекло буфером RT и отмывать в 2 сменах того же
буфера по 5 мин при температуре инкубации.
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 28
- 29
- 30
- 31
- 32
- …
- следующая ›
- последняя »
