Составители:
Рубрика:
А.Ф.Сайфитдинова 25
Протокол 2.5.3. Лигирование разрывов хромосомной ДНК
Лигазный буфер: 0,66M Tris-HCl (pH 7,5); 50мM MgCl
2
; 10мM DTT;
10мM dATP.
1. На сухие или размоченные в 2х SSC препараты нанести 10 мкл лигазного
буфера, содержащего 0,5 единиц Т4 ДНК лигазы, накрыть покровным
стеклом 24х24мм
2
и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
2. Смыть покровное стекло буфером 2хSSC.
3. Провести препарат по серии спиртов повышающейся концентрации.
4. Высушить на воздухе.
Если же нельзя избежать использования фиксирующего раствора,
содержащего уксусную или пикриновую кислоту, для уменьшения
неспецифического мечения проводят предварительную застройку
образовавшихся брешей с последующей лигазной реакцией. Для этого можно
использовать фрагмент Кленова и инкубировать препарат при 37
о
С, как в случае
олигомечения, только без добавления праймеров, или поставить реакцию при
72
о
С с термостабильной полимеразой (протокол 2.5.4).
Протокол 2.5.4. Застройка брешей ДНК термостабильной полимеразой
Реакционная смесь: буфер для Taq ДНК-полимеразы, содержащей 1,5-2,5мМ
MgCl
2
; 0,2мМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов.
1. На сухой препарат нанести 10 мкл реакционной смеси, содержащей
1 единицу Taq-полимеразы, накрыть покровным стеклом 24х24мм
2
и
заклеить по контуру резиновым клеем на основе каучука.
2. Инкубировать 15 мин при 72
о
С.
3. Смыть покровное стекло буфером 2хSSC.
4. Провести лигазную реакцию по протоколу 2.5.3.
Еще один способ борьбы с неспецифическим мечением основан на
«затуплении» 3’-концов ДНК в местах разрывов, в результате чего ДНК-
полимераза не может использовать их в качестве затравки для последующего
синтеза. Для этого также можно использовать фрагмент Клёнова и
инкубировать при 37
о
С или поставить реакцию при 72
о
С с термостабильной
полимеразой (Протокол 2.5.5).
Протокол 2.5.5. Затупление 3’-концов дидезоксирибонуклеотидами
Реакционная смесь: буфер для Taq ДНК-полимеразы, содержащей 2,5мМ
MgCl
2
; 10мкМ каждого из дидезоксирибонуклеотидов.
1. На сухой препарат нанести 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1
единицу Taq-полимеразы, накрыть покровным стеклом 24х24мм
2
и
заклеить по контуру резиновым клеем на основе каучука.
2. Инкубировать 15 мин при 72
о
С.
3. Смыть покровное стекло 0,1М Tris-HCl (pH 9,5).
4. Промыть 2 раза по 10 мин в 0,1М Tris-HCl (pH 9,5).
Страницы
- « первая
- ‹ предыдущая
- …
- 26
- 27
- 28
- 29
- 30
- …
- следующая ›
- последняя »
