Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 26 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 23
Протокол 2.5.1. Выявление однонитевых разрывов ДНК методом ник-
трансляции in situ
Реакционная смесь: 10мкМ бета-меркаптоэтанол; 50мМ Tris-HCl (pH 7,5);
5мМ MgCl
2
; 50 мкг/мл БСА; 50мкМ каждого из дезоксирибонуклеотидов;
20мкМ биотинилированного dUTP и 10 единиц ДНК полимеразы I.
Останавливающий реакцию раствор: 500мМ NaCl; 50мМ ЭДТА.
Блокирующий раствор: 3% БСА в 2х SSC; 0,02% Tween 20.
Детектирующий раствор: авидин, стрептавидин или антитела против биотина,
конъгированные с флуорохромом, разведенные в соответствии с
рекомендациями производителя.
1. На сухой препарат нанести 20 мкл смеси под покровное стекло 24х50мм
2
или 8 мкл под стекло 18х18мм
2
.
2. Инкубировать 1 час при 16
о
С, затем 30 мин при 18
о
С и 30 мин при 20
о
С.
3. Смыть покровное стекло останавливающим реакцию раствором.
4. Отмыть препарат в 2 сменах 2х SSC по 5 мин при комнатной
температуре.
5. Нанести 200 мкл блокирующего раствора под кусочек парафильма и
инкубировать 30-40 мин при 37
о
С во влажной камере.
6. Стряхнуть блокирующий раствор, нанести 100-200 мкл детектирующего
раствора под кусочек парафильма и инкубировать 1 час при 37
о
С во
влажной камере.
7. Отмывать в 4 сменах 2x SSC; 0,02% Tween 20 по 5 мин при 24
о
–37
о
С и
постоянном покачивании.
8. Провести по серии спиртов повышающейся концентрации и высушить на
воздухе.
9. Заключить в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом.
Этапы с 6 по 9 по возможности проводить в темноте.
Мечение ДНК на препаратах позволяет выявить тонкие петли и нити, чего
нельзя сделать окрашиванием ДНК-специфичными красителями и
прижизненным включением меченых предшественников, поскольку в этих
случаях флуоресценция пропорциональна количеству ДНК, а при получении
изображения участки со слабой флуоресценцией просто не детектируются. Если
же мы будем использовать выдержки, достаточные для фиксации слабого
сигнала, то участки с высокой концентрацией ДНК превратятся в огромные
засвеченные пятна. В том случае, когда мы метим ДНК на фиксированном
препарате, реакция проходит только на его поверхности, что выравнивает
интенсивность сигнала в районах с разной концентрацией ДНК.
Для осуществления мечения ДНК на препарате используют метод ник-
трансляции с применением ДНКазы I в концентрации, достаточной для
нанесения одного разрыва на каждые 100 п.н. (Раздел 2.6), а также
олигомечение со случайными праймерами по протоколу олигомечения ДНК в
растворе, но без добавления матрицы (Раздел 2.6). Денатурацию препарата для
последующего олигомечения проводят в 70% формамиде (Протокол 2.5.2).
Успех реакции зависит от качества проведения денатурации, поэтому
необходимо строго соблюдать временной и температурный режимы.

Страницы