Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов. Сайфитдинова А.Ф. - 24 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СПбГУ | Санкт-Петербург

Составители: 

Рубрика: 

А.Ф.Сайфитдинова 21
Протокол 2.4.2. Выявление репликационного бэндинга окраской
акридиновым оранжевым
1. Препараты метафазных хромосом с включенным BrdU опустить на 1-
30 сек в 0,2% раствор акридинового оранжевого в 1х PBS pH 6,0.
2. Сполоснуть в дистиллированной воде и заключить в фотозащитный
раствор.
3. Оставить в темноте при 4
о
С на 12-16 часов, а затем исследовать под
микроскопом.
Антитела против галогенизированных предшественников узнают
модифицированный нуклеотид только в однонитевой последовательности,
поскольку комплементарно связанная вторая цепь маскирует эпитоп. Поэтому
окраска антителами включенных галогенизированных предшественников
(Протокол 2.4.3) требует обязательной предварительной денатурации. Для этого
препарат обрабатывают 0,1N раствором соляной кислоты или инкубируют в
70% формамиде при 70
о
С (Протокол 2.5.2).
Протокол 2.4.3. Иммунохимическое выявление включенного BrdU
Блокирующий раствор: 4% БСА в 1х PBS, 0,05% Tween 20
Раствор для разведения антител: 1% БСА в 1х PBS, 0,05% Tween 20
Антитела против BrdU: развести в соответствии с рекомендациями
производителей.
Вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромом: развести в
соответствии с рекомендациями производителей.
1. Опустить препараты на 5-10 мин в 1х PBS.
2. Денатурировать ДНК инкубацией в 0,1N HCl в течение 5-10 мин при
комнатной температуре.
3. Отмыть в 2 сменах 1х PBS по 5 мин.
4. Инкубировать в блокирующем растворе 10 мин при 37
о
С.
5. Нанести 100 мкл раствора антител против BrdU под кусочек парафильма
24х50мм
2
и инкубировать 30 мин при 37
о
С во влажной камере.
6. Отмыть препараты в 3 сменах 1хPBS; 0,05% Tween 20 при комнатной
температуре, непрерывно качая.
7. Нанести 100 мкл раствора вторичных антител под кусочек парафильма
24х50мм
2
и инкубировать 30 мин при 37
о
С во влажной камере.
8. Отмыть препараты в 3 сменах 1х PBS; 0,05% Tween 20 при комнатной
температуре, непрерывно качая.
9. Провести по серии спиртов повышающейся концентрации и высушить на
воздухе.
10. Заключить в фотозащитную среду и исследовать под микроскопом.
Этапы с 7 по 10 по возможности проводить в темноте.
При исследовании репликации в культуральную среду вводят
галогенизированные предшественники до конечной концентрации 10мкМ.
Время инкубации может колебаться от 15 до 60 мин, в зависимости от целей
эксперимента. При необходимости проведения одновременного мечения ДНК,
реплицирующейся в разное время, используют комбинацию йоддезоксиуридина

Страницы