Методы определения редокс-статуса культивируемых клеток растений. Сибгатуллина Г.В - 55 стр.

                       5.2. Определение содержания белка
     Метод Брэдфорд (Bradford, 1976) основан на сдвиге спектра поглощения
в сторону значений 595 нм красителя кумасси ярко-голубого (Coomassie Blue
G-250) при связывании его с белком, прямо пропорционально концентрации
последнего. Кумасси образует комплекс с белком, в результате чего цвет
красителя из красновато-коричневого становится голубым.
                              Необходимые реактивы:
1) реактив Брэдфорд.
     Приготовление реактива Брэдфорд:
     100 мг красителя Кумасси ярко-голубого (CBB G-250) растворить в 50 мл
96% этанола. Затем к этому раствору, постоянно перемешивая его стеклянной
палочкой, добавить 100 мл 85% фосфорной кислоты. При добавлении
фосфорной кислоты окраска раствора из синего должна перейти в коричневый.
В стакан объёмом 1 л налить 500-700 мл дистиллированной (лучше MQ) воды и
медленно, помешивая воду стеклянной палочкой, добавлять в неё раствор,
содержащий краситель Кумасси голубой, этанол и фосфорную кислоту.
Довести раствор до 1 литра и оставить на ночь при комнатной температуре.
После этого полученный раствор необходимо профильтровать. Реактив
Бредфорд хранить в холодильнике в колбе из темного стекла с притёртой
пробкой. При длительном хранении (более 1 месяца) реактив необходимо
повторно калибровать.
                                   Ход работы
     0,1 мл раствора препарата, содержащего 0,01-0,1 мг испытуемого белка
помещают в пробирки, прибавляют 5 мл реактива Брэдфорд, перемешивают и
оставляют при комнатной температуре в течение одинакового времени в
интервале от 2 до 60 мин (обычно 10 мин). Оптическую плотность измеряют
на спектрофотометре при длине волны 595 нм. В качестве раствора сравнения
вместо образца берут аналогичное количество буфера или экстрагирующего
раствора.
     Примечание.        При     постановке        реакции   Брэдфорд   используют

                                             55