Биотехнология: Монография. Волова Т.Г. - 128 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

127
ДНК, комплиментарная мРНК (кДНК). Полученная комплиментарная
ДНК (кДНК) служит матрицей для синтеза второй нити ДНК с использо-
ванием ДНК-полимеразы или ревертазы. Затравкой при этом служит
олигонуклеотид, комплиментарный 3’-концу мРНК; новая цепь ДНК об-
разуется из дезоксинуклеозидтрифосфатов в присутствии ионов магния.
Метод с большим успехом применен для получения в 1979 г.
гена гормона
роста человека (соматотропина).
Полученный тем или иным способом ген содержит информацию о
структуре белка, но сам не может ее реализовать. Поэтому нужны допол-
нительные механизмы для управления действием гена.
Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществля-
ется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула
ДНК, способная к
самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором
образует рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК
При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается
ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не
происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при вве-
дении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – репли-
цироваться. Вектор также
несет в своем составе генетический признак,
необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных
организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устой-
чивости к антибиотикам.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изо-
лированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расще-
пляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в ли
-
нейную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводи-
мой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются
лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-
лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.
В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы быстро
транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны
быстро
заразить весь организм. Важной проблемой при их использовании являет-
ся аттеньюация – ослабление патогенности для хозяина; таким образом, не
очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать
потомству измененную генетическую программу. Наиболее распростра-
ненными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной
массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впослед-
ствии
их стали конструировать методами генной инженерии.
Использование векторов общего назначения методически – несложная
задача, не требующая специального оборудования. Наиболее используе-
мыми плазмидными векторами для клонирования являются плазмиды E.
coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), а также сконструирован-

Страницы