Биотехнология: Монография. Волова Т.Г. - 130 стр.

UptoLike

ВУЗ: 

СФУ | Красноярск

Составители: 

Рубрика: 

129
Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию
в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией. Методика примени-
тельно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очи-
стку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой
ДНК (присутствие протаминсульфата повышает эффективность транс-
фекции). Методика применима к животным и растительным клеткам с
участием
специальных челночных вирусных векторов.
Скрининг и отбор рекомбинантных клеток
После переноса сконструированных ДНК, как правило, лишь небольшая
часть реципиентных клеток приобретает необходимый ген. Поэтому очень
важным этапом является идентификация клеток, несущих ген-мишень.
На первой стадии идентифицируют и отбирают клетки, несущие век-
тор, на основе которого осуществлен перенос ДНК. Отбор
проводят по
генетическим маркерам, которыми помечен вектор. Главным образом
маркерами являются гены устойчивости к антибиотикам. Поэтому отбор
проводят высевом клеток на среды, содержащие конкретный антибиотик.
После высева на этих средах вырастают только клетки, в составе которых
находится вектор с генами антибиотиковой устойчивости.
На второй стадии отбирают клетки, несущие вектор и ген
-мишень. Для
этого используют две группы методов: 1) основанные на непосредствен-
ном анализе ДНК клеток-реципиентов и 2) основанные на идентификации
признака, кодируемого геном-мишенью. При использовании первой груп-
пы методов из клеток, предположительно содержащих нужный ген, выде-
ляют векторную ДНК, и в ней проводится поиск участков, несущих дан-
ный ген. Далее
проводят секвенирование части нуклеотидной последова-
тельности гена. Возможен другой метод – гибридизация выделенной из
клеток ДНК с зондом (искомый ген или соответствующая ему мРНК); вы-
деленную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во
взаимодействие с зондом. Далее определяют наличие двуцепочечных гиб-
ридных молекул ДНК. Во втором варианте возможен непосредственный
отбор
клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансля-
ции гена-мишени. Применяются также селективные среды, поддержи-
вающие рост только клеток, приобретших ген-мишень.
С помощью методов генетической инженерии возможно конструиро-
вание новых форм микроорганизмов по заданному плану, способных син-
тезировать разнообразные продукты, в том числе эукариотических орга-
низмов. Рекомбинантные микробные клетки
быстро размножаются в кон-
тролируемых условиях и способны утилизировать при этом разнообраз-
ные, в том числе, недорогие субстраты.
Основные проблемы, возникающие при генетических манипуляциях,
заключаются в следующем: 1) гены при трансформации, попадая в чуже-
родную среду, подвергаются воздействию протеаз, поэтому их надо за-
щищать; 2) как правило, продукт трансплантированного гена аккумулиру-

Страницы