Медицинская биохимия. Бескровная Е.В - 30 стр.

разования превращается в относительно устойчивое соединение –     счет разных сил: ионных, водородных, гидрофобных и других в
кетоамин. Образовавшийся кетоамин остается присоединенным к       зависимости от конформации и размера молекул.
белку на весь период его жизни. Гликозилированию подвергаются           В аффинной хроматографии используется нерастворимый
многие белки организма (белки крови, хрусталика, почек, нервов,   носитель, на котором иммобилизуется соединение, называемое ли-
сосудов и др.). Скорость гликозилирования и количество гликози-   гандом; он особым образом связывает подлежащий очистке про-
лированных белков зависит от величины и длительности гипергли-    дукт, находящийся в подвижной, обычно жидкой фазе. Лиганд
кемии и не зависит от уровня инсулина.                            удерживается за счет ковалентных связей, иногда пользуются ион-
      Таким образом, если измерение концентрации глюкозы в        ным обменом, адсорбцией и др.
крови дает представление о показателях уровня гликемии в момент         Раствор, в котором находятся молекулы, вступает в контакт с
проведения теста, то измерение гликозилированного гемоглобина     неподвижным лигандом. Из всех веществ удерживаются те, чьи
дает более обширную картину – среднюю концентрацию глюкозы        молекулы способны соединяться с лигандом.
за последние два–три месяца. У здорового человека содержание            Разрыв связей может происходить за счет действия агента,
гликозилированного гемоглобина изменяется в диапазоне 4,5÷7 %.    связывающегося с молекулой вместо лиганда, или агента, способ-
      Для количественного анализа гликозилированного гемогло-     ного связываться с лигандом вместо молекулы.
бина разработано множество методов: хроматографические, коло-            В методе микроколоночной хроматографии используется
риметрические и электрофорез. В данной работе для определения     цельная стабилизированная кровь. Гемолизат цельной крови, нане-
содержания гликозилированного гемоглобина применяется метод       сенный на хроматографическую микроколонку, элюируется фос-
микроколоночной хроматографии.                                    фатным буфером с низкой ионной силой. При этом НbA1c задержи-
                                                                  вается катионообменной смолой, а НbA1a, НbA1b и липиды вымы-
                                                                  ваются. Последующее элюирование буфером с более высокой ион-
     Метод микроколоночной хроматографии                          ной силой позволяет собрать фракцию, содержащую НbA1c, и опре-
     Хроматография – метод разделения веществ и определения       делить ее оптическую плотность. Измерение оптической плотности
их физико-химических характеристик, основанный на различии        неэлюированного гемолизата, величина которой соответствует об-
скоростей движения и размывания концентрационных зон иссле-       щей концентрации гемоглобина, позволяет рассчитать уровень
дуемых компонентов, которые движутся в потоке подвижной фазы,     НbA1c в процентах от общей концентрации гемоглобина.
причем исследуемые вещества находятся в обеих фазах. Необходи-           Метод определения содержания гликозилированного гемо-
мым условием разделения является различие между подвижной и       глобина, использующийся в данной работе, основан на аффинной
неподвижной фазой в равновесном распределении или кинетике его    хроматографии. Заполняющий микроколонки сорбент обеспечивает
установления для анализируемых соединений.                        на первой стадии специфическое связывание гликозилированного
     Чаще всего для определения гликозилированного гемоглоби-     гемоглобина (фракция Б) и его отделение от негликозилированной
на используется аффинная хроматография. Она основана на уста-     фракции (фракция А). На второй стадии происходит полное вытес-
новлении обратимых молекулярных взаимодействий, присущих          нение гликозилированной фракции за счет вымывания из сорбента
биологически активным веществам, в частности гемоглобину.         растворителем.
     Аффинная хроматография – разновидность адсорбционной,              По измеренным оптическим плотностям обеих фракций при
при которой связывание происходит в соответствии со специфиче-    длине волны 414 нм можно вычислить содержание гликозилиро-
скими свойствами двух молекул. Взаимодействие происходит за       ванного гемоглобина [ HbA1c ] в анализируемом образце крови:

                              59                                                                 60