ВУЗ:
Составители:
Рубрика:
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА
Гель-фильтрационное разделение макромолекул
Теоретические основы гельпроникающей хроматографии.
Гель-фильтрационная колонка, заполненная гранулами
набухшего геля, уравновешенного каким-либо буферным
раствором, характеризуется следующими параметрами:
свободным или наружным объемом (объем буферного
раствора, находящегося вне гранул геля), V
H
;
внутренним объемом (объем буфера, находящегося в
порах гранул геля), V
B
;
общим объемом колонки (равен V
H
+ V
B
+ V
r
, где V
r
— объем матрицы геля), V
o
.
Объем, занимаемый гранулами геля, равен V
o
—V
H
.
При прохождении через колонку молекул, размеры которых
больше пор гранул, они элюируются одним пиком сразу
после прохождения V
H
. Молекулы, размеры которых
меньше нижнего предела интервала фракционирования,
равномерно распределяются между наружным и
внутренним объемами растворителя, продвигаются через
колонку, как при отсутствии геля, и выходят из нее после
того, как пройдет общий объем колонки. При гель-
фильтрации молекул, размеры которых находятся в
пределах интервала фракционирования данного типа
геля, они распределяются в объеме, находящемся внутри и
вне гранул геля, главным образом в соответствии со своими
размерами. Теоретически объемы элюирования молекул
связаны не с размерами молекул, а с их стоксовскими
радиусами и выходят из колонки в соответствующих
объемах элюирования (V
э
). При этом получают так
называемые диаграммы элюирования гетерогенных смесей
молекул. Определив для данной колонки и типа геля
значения V
H
> V
o
и Vэ фракционируемых молекул, можно
рассчитать их коэффициенты распределения (К):
К = (VЭ -VН )/(VO -VH ),
откуда значения К молекул, размеры которых больше
величины пор гранул геля, равны нулю, а малых молекул,
равномерно распределяющихся между V
H
И V
B
, —1.
Разделение смеси веществ при фильтровании через гели
тем эффективнее, чем больше их различия в значениях К.
Условием полного разделения смеси двух веществ является
нанесение их на колонку в объеме, не превышающем
величины К
2
— K
1
V
B
. Для достижения высокой степени
разделения объем образца должен быть меньше
рассчитанного теоретически. Полезный диапазон объемов
элюции разделяемых глобулярных молекул составляет
около 55 % V
o
. Так, для колонки с Vo, равным 100 мл,
эффективное разделение молекул происходит в диапазоне
объемов элюции от 35 до 90 мл, причем максимальное
разрешение наблюдают между пиками молекул,
выходящими из колонки с 60 мл элюата.
Если значение К для фракционируемого вещества
отлично от нуля и единицы, то величину V
3
при малом
объеме нанесенной пробы определяют по формуле
V Э = VН + К ·V
В
Следует отметить, что некоторые молекулы могут
задерживаться в колонке дольше рассчитанного
теоретически времени, что обусловлено их адсорбцией на
матрице, ионным обменом или другими взаимодействиями.
Экспериментально установлена зависимость между
логарифмами молекулярных масс молекул одной формы
(lgM) и коэффициентами их распределения (К), носящая
линейный характер. Пропуская через колонку стандартных
размеров молекулы с К=0 (обычно используют голубой
декстран, М 2-10
6
) и 1, а также молекулы с известными
молекулярными массами, находящимися в пределах
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА К= (VЭ-VН)/(VO-VH),
Гель-фильтрационное разделение макромолекул откуда значения К молекул, размеры которых больше
величины пор гранул геля, равны нулю, а малых молекул,
Теоретические основы гельпроникающей хроматографии. равномерно распределяющихся между VH И VB, —1.
Гель-фильтрационная колонка, заполненная гранулами Разделение смеси веществ при фильтровании через гели
набухшего геля, уравновешенного каким-либо буферным тем эффективнее, чем больше их различия в значениях К.
раствором, характеризуется следующими параметрами: Условием полного разделения смеси двух веществ является
свободным или наружным объемом (объем буферного нанесение их на колонку в объеме, не превышающем
раствора, находящегося вне гранул геля), VH; величины К2 — K1VB. Для достижения высокой степени
внутренним объемом (объем буфера, находящегося в разделения объем образца должен быть меньше
порах гранул геля), V B ; рассчитанного теоретически. Полезный диапазон объемов
общим объемом колонки (равен V H + V B + V r , где V r элюции разделяемых глобулярных молекул составляет
— объем матрицы геля), V o . около 55 % Vo. Так, для колонки с Vo, равным 100 мл,
Объем, занимаемый гранулами геля, равен Vo—VH . эффективное разделение молекул происходит в диапазоне
При прохождении через колонку молекул, размеры которых объемов элюции от 35 до 90 мл, причем максимальное
больше пор гранул, они элюируются одним пиком сразу разрешение наблюдают между пиками молекул,
после прохождения VH. Молекулы, размеры которых выходящими из колонки с 60 мл элюата.
меньше нижнего предела интервала фракционирования, Если значение К для фракционируемого вещества
равномерно распределяются между наружным и отлично от нуля и единицы, то величину V3 при малом
внутренним объемами растворителя, продвигаются через объеме нанесенной пробы определяют по формуле
колонку, как при отсутствии геля, и выходят из нее после VЭ= VН+К·VВ
того, как пройдет общий объем колонки. При гель-
фильтрации молекул, размеры которых находятся в
пределах интервала фракционирования данного типа Следует отметить, что некоторые молекулы могут
геля, они распределяются в объеме, находящемся внутри и задерживаться в колонке дольше рассчитанного
вне гранул геля, главным образом в соответствии со своими теоретически времени, что обусловлено их адсорбцией на
размерами. Теоретически объемы элюирования молекул матрице, ионным обменом или другими взаимодействиями.
связаны не с размерами молекул, а с их стоксовскими Экспериментально установлена зависимость между
радиусами и выходят из колонки в соответствующих логарифмами молекулярных масс молекул одной формы
объемах элюирования (Vэ). При этом получают так (lgM) и коэффициентами их распределения (К), носящая
называемые диаграммы элюирования гетерогенных смесей линейный характер. Пропуская через колонку стандартных
молекул. Определив для данной колонки и типа геля размеров молекулы с К=0 (обычно используют голубой
значения VH> Vo и Vэ фракционируемых молекул, можно декстран, М 2-106) и 1, а также молекулы с известными
рассчитать их коэффициенты распределения (К): молекулярными массами, находящимися в пределах
