Современные методы исследований в биохимии. Битуева А.В - 5 стр.

 матричного    раствора     прибавить     три    объема     «носику» тефлоновый капилляр длиной не менее 105 см.
 дистиллированной воды.                                     Если капилляр трудно одевать на «носик» колонки, его
                                                            конец следует опустить на 5-7 мин в дихлорэтан или хлоро-
                                                            форм. Свободный конец капилляра закрепить. Налить в ко-
     Подготовка сефадекса (молселекта) к
                                                            лонку до высоты 70 см ЗФР хлорида натрия (рН 7,5) —
хромат о г р а ф и и . Взвесить 10 г сефадекса G-75 (для
                                                            элюирующий буфер.
гель-фильтрации) и внести его тонкой струей, постепенно
                                                                Стеклянной палочкой с резиновой муфтой на конце
перемешивая стеклянной палочкой, в цилиндр (1000 мл),
                                                            опустить на дно колонки диск из стекловолокна и
содержащий 700—800 мл дистиллированной воды. Материал
                                                            засыпать его сверху (0,5—1,0 см) порошком из кварцевого
оставить в цилиндре на один день для набухания. Время
                                                            стекла или стекла пирекс. Уложить частицы строго
набухания геля можно сократить до 5 ч при 90 °С.
                                                            горизонтально с помощью стеклянной палочки или слегка
     После набухания гранул сефадекса удалить мелкие и
                                                            встряхивая колонку.
крупные частицы геля. Для удаления мелких частиц гель
                                                                Из колбы Бунзена налить в колонку до шлифа гель
тщательно перемешать в цилиндре и дать ему отстояться.
                                                             сефадекса. Необходимо следить, чтобы температура
По мере оседания основной массы гранул верхний мутный
                                                             буферного раствора, находящегося в колонке, и вносимого
слой воды с обломками гранул геля отсасывать трубкой.
                                                             геля были одинаковыми. По мере оседания гранул геля и
Процесс декантации мелких частиц повторить три-четыре
                                                             вытекания элюирующего буфера добавлять в колонку новые
раза. Для удаления крупных частиц гель тщательно
                                                             порции носителя. При заполнении колонки таким способом
размешать и через 3—5 мин аккуратно перелить в
                                                             скорость вытекания через капилляр элюирующего раствора
свободную емкость, оставив на дне слой геля 1—1,5 см.
                                                             постепенно уменьшается, в то время как гранулы геля
     К объему набухшего сефадекса добавить равный
                                                             осаждаются все быстрее и быстрее. Чтобы избежать
объем хлорида натрия (0,26 моль/л), забуференного натрий-
                                                             образования прерывистых зон геля, часть надосадочной
фосфатным буферным раствором (0,04 моль/л), рН 7,5,
                                                             жидкости декантируют и вносят в колонку новые порции
тщательно перемешать, дать отстояться и удалить
                                                             геля.
надосадочную жидкость.
                                                                 После образования столба геля высотой примерно 95—
     Перелить гель в колбу Бунзена, закрыть ее резиновой
                                                            97 см поднять капилляр выше уровня буфера в колонке и
пробкой и соединить с вакуумным насосом. Колбу обернуть
                                                            строго горизонтально положить на гель кружок
мягкой тканью, включить вакуумный насос и дегазировать
                                                            фильтровальной бумаги, плотно прилегающий к стенкам
гель 10—15 мин. По окончании дегазации снять
                                                            колонки. При заполнении колонки гелем, внесении образца
соединительную трубку из колбы и открыть пробку.
                                                            и выполнении всех последующих операций необходимо
Сефадекс готов для внесения в колонку.
                                                            следить, чтобы гель постоянно находился под слоем
     Подготовка           к    работе     стеклянной
                                                            жидкости, т. е. не контактировал с воздухом.
гель-фильтрационной колонки.
                                                                  Присоединить       к     колонке     капилляр    от
Стеклянную колонку с плоским дном и шлифом (100X2 см)       перистальтического насоса, наслоить на столб геля вплоть
укрепить на штативе строго вертикально. Присоединить к ее