Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 23 стр.

                                  23
морфизм конкретных локусов, для которых хотя бы частично известная
нуклеотидная последовательность. Использование таких маркеров было
рассмотрено выше (рис. 6-8).
      Методика ПЦР позволяет амплифицировать ДНК из любого участка
генома, в том числе фрагменты ДНК с неизвестной (анонимной) нуклео-
тидной последовательностью (при использовании RAPD-маркеров). При
RAPD-методе используют стандартные наборы праймеров – случайные
(произвольные) праймеры. Использование олигонуклеотидных праймеров
произвольной структуры основано на том, что в больших геномах для них
имеются множественные сайты посадки, а следовательно, и инициации
ПЦР. В этом случае используется, как правило, только один праймер и ам-
плифицируются участки между этим праймером и его обратной (инверти-
рованной) последовательностью. Праймер связывается с геномной ДНК в
двух различных участках – инвертированных повторов (ип). Инвертиро-
ванные повторы – это участки молекулы ДНК, два сегмента которых име-
ют одинаковую нуклеотидную последовательность, но противоположную
ее ориентацию.
      G A       C     A G A ... A G A                  C   A G
      �     �   �     �    �    �        �   �    �    �   �   �
      C     T   G     T   C     T ... T      C    T    G   T   C
       Обычно используются произвольные праймеры из 10 нуклеотидов,
содержащие не менее 50% GC. Так как пара G-C содержит три водородных
связи, а пара A-T – только две, гибрид “ДНК-праймер”, содержащий менее
50% GC, плавится до того, как полимераза начинает полимеризацию и
продукты амплификации в этом случае не образуются. Продукты RAPD-
ПЦР представляют собой анонимную последовательность ДНК, заключен-
ную между двумя инвертированными повторами, разной длины. Их выяв-
ляют гель-электрофорезом (как присутствие или отсутствие отдельной
RAPD-полосы). RAPD-маркеры являются высокоинформативной характе-
ристикой для оценки генетического разнообразия и родства. Типичная
схема метода RAPD-ПЦР представлена на рисунке (рисунок 9).
      На рисунке 10 представлен пример электрофореграммы продуктов
ПЦР с использованием универсального (произвольного) праймера.
      Для некоторых RAPD-маркеров установлена связь с генами устойчи-
вости к заболеваниям. На сельскохозяйственных растениях показана
возможность использования RAPD-маркеров в селекции на гетерозис: для
оценки генетического разнообразия исходных инбредных линий и подбора
родительских пар для создания высокогетерозисных гибридов и др. Одним
из недостатков RAPD-маркеров является их доминантное (а не кодоми-
нантное) наследование. Считают, что в F2 доминантные маркеры дают в 2
раза меньше информации, чем кодоминантные. Эти недостатки RAPD-
маркеров преодолевают с помощью методов, занимающих промежуточное
положение между ПДРФ- ПЦР - анализом. Среди них особый интерес
представляют AFLP-маркеры.