Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 53 стр.

                                   53
имущество ДНК-диагностики – это возможность установить первопричину
патологии, т.е. нарушения структуры гена. С помощью ДНК-диагностики
сейчас выявляют уже более 500 НЗЧ, в том числе 50 наиболее распростра-
ненных выявляют в России.
      Молекулярно-генетические методы, т.е. методы ДНК-диагностики
прочно вошли в медико-генетическую практику с 70-80х годов XX века.
Все они основаны на выявлении и изучении мутаций и могут быть подраз-
делены на прямые и косвенные.
      Прямые методы ДНК-диагностики возможны лишь при условии, что
ген заболевания клонирован, известна его экзон - интронная организация
или нуклеотидная последовательность его кДНК. Поскольку предметом
анализа при этом являются мутации гена, эффективность прямой диагно-
стики составляет 100%. Однако гены большинства наследственных заболе-
ваний еще не клонированы или заболевание может быть обусловлено по-
вреждением нескольких генов. В таких случаях применяют косвенные ме-
тоды ДНК-диагностики, основанные на использовании сцепленных с ге-
ном полиморфных маркеров. Поэтому необходимым условием использо-
вания косвенных методов ДНК-диагностики является обязательное пред-
варительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного
родственника.
      Среди основных методов ДНК-диагностики выделяют:
      - различные методы молекулярной гибридизации нуклеиновых ки-
слот: гибридизация in situ (ISH- и FISH- гибридизация), дот-гибридизация,
дозовый блот-гибридизационный анализ и др., часть из которых были рас-
смотрены выше;
      - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ);
      - полимеразная цепная реакция (ПЦР);
      - анализ полиморфизма микросателлитных последовательностей.
      Дот-гибридизация. При диагностике инфекционных заболеваний
часто используют метод дот-гибридизации (от англ. dot – точка). Этот ме-
тод является модификацией метода молекулярной гибридизации и приме-
няется, когда необходимо установить факт наличия определенной нуклео-
тидной послдовательности в исследуемых образцах и оценить ее количест-
во. Из подходящей ткани (крови, амниотической жидкости, плаценты, уда-
ленной опухоли или спермы человека; печени или хвоста мыши; листьев
растения и т.д.) выделяют суммарную ДНК. Образцы ДНК наносят на
микропористый (нитроцеллюлозный или капроновый) фильтр, денатури-
руют и иммобилизуют облучением ультрафиолетом, после чего инкуби-
руют с меченым зондом. При этом на один фильтр могут быть нанесены
десятки образцов нуклеиновых кислот, выделенных из биологических
жидкостей разных пациентов. Меченые зонды, используемые в диагности-
ке, комплементарны какой-либо последовательности ДНК или РНК (в слу-
чае заражения РНК-содержащими вирусами), специфичной для возбудите-
ля заболевания. За несколько часов можно получить ответ, инфицирован
ли пациент определенным вирусом или микроорганизмом и как много чу-