Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 54 стр.

                                  54
жеродной нуклеиновой кислоты присутствует в образце. От результатов
такого анализа зависит тактика лечения больного.
      Блот-гибридизация. В том случае, когда требуется более детальная
информация о расположении выявляемой специфической нуклеотидной
последовательности в геноме, применяется другая модификация метода
молекулярной гибридизации - блот-гибридизация (от англ. to blot – про-
макать фильтровальной бумагой), предложенной еще в 1975 г. Эта методи-
ка является универсальной технологической основой.
      Сущность методики заключается в следующем: ДНК, выделенная из
ткани любого органа, клеток крови или клеток, культивируемых вне орга-
низма, подвергается расщеплению рестрикционными нуклеазами (рест-
риктазами), которые “узнают” в ней строго определенную последователь-
ность нуклеотидов. Рестриктазы называют “биологическими ножницами”
(их известно уже более 500). Набор фрагментов ДНК, полученный при
разрезании определенной рестриктазой, специфичен для каждого организ-
ма.
      Чтобы из множества нарезанных рестриктазой фрагментов (от не-
скольких тысяч до десятков миллионов) найти один или несколько с опре-
деленной нуклеотидной последовательностью и охарактеризовать эти
фрагменты, полученную смесь ДНК подвергают электрофорезу. При этом
фрагменты разделяются по размеру (мелкие в геле мигрируют быстрее
больших). Разделенные фрагменты “перепечатывают” на фильтр (специ-
альным образом обработанную бумагу, нитроцеллюлозу или нейлон), фик-
сируют (иммобилизуют) на нем и подвергают гибридизации с зондом
(олигонуклеотидом), меченным радиоактивным изотопом или флюорес-
центной меткой. Зонд является ключевым элементом диагностической
схемы.
      Зонд – это олигонуклеотид (короткий: 10-30 нуклеотидов, меченый
тем или иным способом сегмент одноцепочечной ДНК, или РНК, или ее
ДНК-копии), использующийся для выявления комплементарных последо-
вательностей с помощью гибридизации. Зонд – это клонированная генно-
инженерными методами нуклеотидная последовательность конкретного
гена, подлежащего исследованию, или последовательность, синтезирован-
ная искусственно.
      Зонд выявляет необходимый фрагмент, если он присутствует среди
исследуемого множества фрагментов. Это происходит путем специфиче-
ского связывания последовательностей зонда с комлементарными ему по-
следовательностями фрагмента, зафиксированными на фильтре. Узнать об
этом можно по проявляющейся в таком случае радиоактивной или флуо-
ресцентной метке. Если в зонде содержится радиоактивная метка, фильтр в
темноте накрывают рентгеновской пленкой, а по прошествии определен-
ного времени (от нескольких часов до нескольких суток) ее проявляют и
по засвеченным полосам определяют, в фрагментах какой длины находит-
ся комплементарная зонду нуклеотидная последовательность. Если зонд
несет флуоресцентную метку, фильтр фотографируют в ультрафиолетовом