Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 56 стр.

                                  56
ложительно содержащих мутации, а затем секвенируют только эти участки
ДНК. Методы поиска фрагментов ДНК, содержащих мутации, основаны на
сравнительном анализе мутантных и нормальных последовательностей по
целому ряду физических и химических характеристик, которые в значи-
тельной степени варьируют от типа мутационного повреждения. Но неза-
висимо от метода выявления мутаций, точные молекулярные характери-
стики мутаций могут быть получены путем прямого секвенирования. Му-
тации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, выявляются
легко при электрофорезе. Такое, в частности, будет иметь место при мик-
роделециях или вставках. Но при мутациях генов, представляющих собой
замену одного или нескольких нуклеотидов, длины амплифицированных
фрагментов остаются постоянными.
      Выявление генных мутаций путем оценки конформационного
полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP). Однако некоторые физико-
химические свойства мутантных молекул меняются. С учетом этих осо-
бенностей разработаны различные методы поиска мутантных фрагментов.
Например, методами анализа конформационного полиморфизма одноните-
вой ДНК (SSCP – Single Strand Conformational Polymorfism). Он основан на
регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых
ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотид-
ных замен по пространственной организации молекул. Конформация не-
больших однонитевых ДНК зависит от нуклеотидной последовательности,
поэтому замена даже одного нуклеотида приводит к изменению их про-
странственной структуры.
      Метод включает амплификацию фрагментов ДНК (экзонов иссле-
дуемого гена), денатурацию продуктов ПЦР и электрофорез в ПААГ. В
качестве матрицы для ПЦР используют ДНК больных и здоровых (кон-
троль) индивидов. Каждая пара праймеров выбирается из последователь-
ностей, фланкирующих экзон, или из его концевых участков. Вследствие
комплементарности две цепи одной молекулы ДНК имеют разную нуклео-
тидную последовательность, а поэтому принимают разную трехмерную
конфигурацию и мигрируют при гель-электрофорезе с разной скоростью.
В результате после разделения в геле наблюдаются 2 полосы, отвечающие
разным комплементарным цепям. Если две молекулы, представляющие
один и тот же участок гена, но полученные из разных источников, разли-
чаются одной парой нуклеотидов, то конформация одиночных нитей ткаих
молекул ДНК будет различаться, т.е. каждая из четырех цепей будет пере-
мещаться при гель-электрофорезе со своей скоростью (рисунок 17). С по-
мощью SSCP можно локализовать нуклеотидные изменения в определен-
ном экзоне или специфической области гена, а определить природу мута-
ции может лишь секвенирование. Метод оценки конформационного поли-
морфизма одноцепочечных фрагментов ДНК прост в постановке и позво-
ляет выявлять до 80% мутаций.
      Поиск мутаций путем анализа гетеродуплексов (Heteroduplex
analysis, HA). Еще одним прямым новым методом ДНК-диагностики явля-