Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 58 стр.

                                 58
      В настоящее время наиболее распространенным способом скрининга
мутаций является комбинация анализа гетеродуплексов и метода однони-
тевого конформационного полиморфизма, позволяющая выявить точковые
мутации почти в 100% случаев и не требующих больших затрат времени.
      Метод “трансляции белкового продукта”. Прямым методом ДНК-
диагностики является также метод “трансляции белкового продукта”. Он
используется для диагностики мутаций, прерывающих синтез белкового
продукта, в результате чего образуются укороченные полипептидные цепи,
функционально незначимые. Этот метод проводится в системе in vitro на
основе полученной специфической мРНК с добавлением лизата ретикуло-
цитов, в котором содержатся все необходимые компоненты для синтеза
белка. В этой системе синтезируется белковый продукт соответствующего
гена.
      Продукт транскрипции анализируется с помощью электрофореза.
Изменение электрофоретической подвижности белка свидетельствует о
наличии мутации (нонсенс-мутация, нарушение сплайсинга РНК, сдвиг
рамки считывания), прерывающей синтез полипептидной цепи.
      Все методы, описанные выше, приобрели особую значимость с раз-
витием метода ПЦР, который достаточно просто позволяет амплифициро-
вать конкретные участки геномной ДНК, получать препаративные количе-
ства гомогенной по размерам двухцепочечной ДНК и быстро создавать ге-
теродуплексы.
      При косвенной ДНК-диагностике используются те же технические
приемы, что и при прямой (получение ДНК, рестрикция, электрофорез), а
также необходим математический анализ сцепления признаков.
      Использование косвенных методов ДНК-диагностики оказалось воз-
можным благодаря присутствию в геноме полиморфных участков (локу-
сов) ДНК. Нуклеотидные замены нередко встречаются в некодирующих
участках ДНК. Значительное число нуклеотидных замен приводит к изме-
нению мест рестрикции. Эти изменения можно выявить с помощью блот-
гибридизации по Саузерну, поскольку изменяется длина рестрикционных
фрагментов. Эта разновидность полиморфизма ДНК получила название
полиморфизма по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
      Расположенный вблизи изучаемого гена или внутри его полиморф-
ный сайт может служить маркером аллельных вариантов этого гена, в том
числе маркером патологических мутаций.
      Таким образом, косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу по-
лиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи.
Маркеры должны быть расположены в том же хромосомном районе, что и
ген болезни, т.е. они должны быть сцеплены. Однако полиморфизм, обу-
словленный нуклеотидными заменами или делециями, как правило, диал-
лелен, следовательно, его информационная ценность ограничена.
      Более информативными являются кластеры тандемных повторов, ко-
торые обусловливают полиморфизм по количеству копий (VNTR-variable