Картирование генома и обратная генетика. Буторина А.К - 55 стр.

                                  55
свете. Зонды используют и для поиска мутантного гена непосредственно
на хромосоме. Мутантный ген при этом можно также обнаружить либо
при использовании радиоактивно меченого зонда (ISH- метод), либо зонда,
меченого флуоресцентным красителем (FISH- метод). FISH- метод имеет
определенные преимущества перед ISH-методом потому, что при этом
происходит более точная локализация гибридизационного сигнала на хро-
мосоме. Кроме того, нерадиоактивная метка безопасна для здоровья об-
служивающего персонала. Возможно применение не одного, а нескольких
ДНК-зондов с различной цветовой окраской.
      Применение ПЦР. Для выявления точковых мутаций, небольших
делеций и инсерций в исследуемых генах, а также искомой нуклеотидной
последовательности (присутствующей в недостаточном для обнаружения
количестве) используют различные подходы, основанные на методе ПЦР,
благодаря которому можно многократно увеличить (амплифицировать)
уникальную последовательность ДНК, а затем проанализировать для вы-
явления мутаций или специфической последовательности. Недостаточным
может быть и само количество ткани, доступной для проведения анализа.
Во всех этих случаях перед нанесением образца на фильтр к амплифика-
ции (умножении) нуклеотидного материала с помощью ПЦР.
      Амплификация ничтожных количеств исходного биологического ма-
териала в сочетании с молекулярной гибридизацией позволяет обнаружить
одну клетку, инфицированную ВИЧ среди 105 неинфицированных клеток
носителя СПИДа. Применение ПЦР делает возможным однозначное уста-
новление личности преступника по одному волосу, засохшей капле спер-
мы, слюны или крови с использованием метода “геномной дактилоско-
пии”, также основанного на принципах молекулярной гибридизации.

3.2. Обнаружение мутаций при наследственных заболеваниях человека

      Секвенирование ДНК как способ обнаружения мутаций. Прямое
секвенирование продуктов ПЦР является очень эффективным и чувстви-
тельным методом выявления мутаций. Принято считать, что с помощью
прямого секвенирования одноцепочечных и двухцепочечных продуктов
ПЦР стандартными методами можно обнаруживать до 99% мутаций. Ме-
тод позволяет не только точно локализовать мутацию в исследуемой по-
следовательности нуклеотидов, но и определить ее тип и возможный меха-
низм возникновения с учетом контекста окружающих ее нуклеотидов.
      Любые типы мутаций могут быть обнаружены методом прямого сек-
венирования мутантной кДНК или отдельных экзонов. Как основной, этот
метод применяется для сканирования мутаций в генах, имеющих малые
размеры (например, в гене фактора IX свертывания крови, ответственного
за гемофилию В). Однако секвенирование полноразмерной кДНК (т.е. всех
экзонов) у пациентов для определения мутаций достаточно трудоемко, до-
рого и требует больших затрат времени. Поэтому на практике чаще прово-
дят предварительный отбор для амплификации фрагментов ДНК, предпо-